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康 涛，郭晓敏，王 涛，雷 琦，杨 谦，郭荷娜
(陕西省人民医院神经内二科，陕西 西安 710068)
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)，又名震颤麻痹，是除了阿尔兹海默病外的第二大中枢神经系统退行性疾病，多发于中老年人[1]。帕金森病的病理机制复杂，近年来对神经退行性病变发病机制的研究发现，小胶质细胞介导的脑内慢性炎症反应可能是其重要病理特征之一[2]。小胶质细胞是中枢神经系统中最主要的免疫细胞，脑部炎症发生后，小胶质细胞产生并释放大量的炎症因子到病变区，进一步加重大脑的炎症损伤[3-4]。因此，如何减少小胶质细胞的炎症反应是减轻大脑继发性损伤的关键所在。
NLRC3是含有CARD(Caspase-recruitment domain)结构域的NOD样受体家族3的简称，在多种疾病中起抑制炎症反应、调控细胞增殖、抑制肿瘤发生的作用[5-6]。据报道，提高NLRC3的表达可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路介导的脑脊髓炎[7]。另有研究表明，NLRC3参与调节小胶质细胞的发育[8]。然而，NLRC3在小胶质细胞炎症反应中的作用及分子机制尚不清楚。本研究通过过表达小胶质细胞BV2中的NLRC3，来探究其对LPS诱导的炎症反应的影响以及作用机制。
1.1 实验材料 小鼠小胶质细胞BV2购于中国科学院细胞库；
一抗抗体与二抗抗体均购自Abcam公司；
BCA蛋白质定量检测试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；
RPMI1640培养基、胎牛血清购自美国Hy Clone公司；
TRIzol购自美国Invitrogen公司；
Ad-NLRC3-GFP(Ad-NLRC3)及其对照空载体Ad-CONl7-GFP(Ad-NC)腺病毒购自上海吉凯基因公司；
PCR引物由上海生工生物科技有限公司完成；
一氧化氮(NO)测定试剂盒购自南京建成生物技术有限公司；
ELISA试剂盒购自北京东哥生物科技公司；
二氧化碳培养箱购自上海力申科学仪器有限公司；
罗氏96荧光定量PCR仪购自美国Roche Applied Science公司；
iMark酶标仪购自美国BIO-RAD公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养：小鼠小胶质细胞BV2常规培养于RPMI1640培养液(含10%胎牛血清及双抗)中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱，隔天换液，细胞融合至80%～90%时传代，传至第三代后给予LPS刺激，24 h之后进行后续实验。
1.2.2 细胞转染：将生长状况良好的BV2细胞计数后均匀接种于6孔培养板中，当细胞融合度达到80%左右，按复合感染指数(MOI)=100加入腺病毒液感染48 h。之后利用荧光显微镜观察细胞的GFP荧光强度。
1.2.3 实时定量PCR：根据Trizol法提取细胞中总RNA，并检测总RNA的完整性及纯度，接着利用反转录试剂盒将RNA反转成cDNA，再使用荧光定量PCR仪进行荧光定量检测。NLRC3上游引物序列为5’-CTACCCAAGGCATTCAGCCA-3’，下游引物序列为5’-ACACCTCTTGCTTCCTCGTG-3’；
内参基因GAPDH上游引物序列为5’-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3’，下游引物序列为5’-TGCTTCACCACCTTCTTGATG-3’。PCR循环程序为95 ℃预热3 min，94 ℃变性20 s，59 ℃退火30 s，72℃延伸20 s，共35个循环。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。
1.2.4 Western blot：收集各组细胞，提取细胞总蛋白。使用BCA蛋白质定量检测试剂盒测定蛋白含量，将蛋白上样至SDS-PAGE中，130 V恒压电泳2 h；
湿转法将蛋白转移至PVDF膜上；
用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲液封闭1 h，裁剪后与一抗4 ℃孵育过夜；
TBST清洗膜8 min，重复4次，加相应的HRP标记的二抗，室温孵育2 h；
TBST重复清洗膜4次，用ECL法显像，用Image J软件进行灰度分析。
1.2.5 CCK-8法检测细胞活力：利用不同浓度LPS(0.1、1、2、5 g/ml)处理小胶质细胞，每组设置6个重复，于37 ℃，5% CO2培养箱内孵育。48 h后加入10 μl CCK-8试剂并继续孵育4 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。
1.2.6 比色法检测NO含量：将小胶质细胞分为未处理组，LPS处理组，LPS+Ad-NC处理组，LPS+Ad-NLRC3处理组，每组设置6个重复，于37 ℃、5% CO2培养箱内孵育。48 h后裂解细胞，按照检测试剂盒说明书检测NO含量。
1.2.7 ELISA测定白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平:将小胶质细胞分为未处理组，LPS处理组，LPS+Ad-NC处理组，LPS+Ad-NLRC3处理组，每组设置6个重复，于37 ℃、5% CO2培养箱内孵育。48 h后收集培养基上清液，然后严格按照ELISA试剂盒说明书进行检测。
1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计学软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两个样本均数比较使用t检验，多个样本间比较使用ANOVA方差分析；
P<0.05为差异具有统计学意义。
2.1 LPS处理对BV2细胞活力的影响 使用不同浓度LPS(0.1、1、2、5 g/ml)处理BV2细胞后，其细胞活力分别为(98.67±6.38)%、(85.24±2.64)%、(78.37±8.11)%、(69.55±4.77)%。与未处理组相比，1、2、5 g/ml LPS处理组的细胞活力显著降低(P<0.05)，而0.1 g/ml LPS处理组与未处理组之间比较无统计学差异(P>0.05)。见图1。
注：与未处理组比较，*P<0.05
2.2 LPS处理对NLRC3表达的影响 qRT-PCR与Western blot检测结果显示，与未处理组比较，LPS处理后的BV2细胞中NLRC3的mRNA与蛋白表达量下降(图2A、2B)，差异有统计学意义(P<0.05)。而Ad-NLRC3显著提高了BV2细胞中NLRC3的mRNA与蛋白表达水平(P<0.05，图2A、C)。
注：与未处理组比较，*P<0.05；
与LPS+Ad-NC组比较，#P<0.05
2.3 过表达NLRC3抑制LPS诱导的NO释放 NO含量检测结果表明，LPS显著增加了BV2细胞中NO的释放，而Ad-NLRC3显著抑制了LPS诱导的NO释放，比较差异有统计学意义(均P<0.05)。见图3。
注：与未处理组比较，*P<0.05；
与LPS+Ad-NC组比较，#P<0.05
2.4 过表达NLRC3抑制LPS诱导的炎症因子表达 本实验利用ELISA和qRT-PCR测定BV2细胞培养上清液中炎症因子的表达水平。ELISA结果显示，经LPS处理的细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量显著增多，而Ad-NLRC3抑制了它们的表达(图4A)，相比较差异有统计学意义(均P<0.05)。同样，qRT-PCR的结果显示，Ad-NLRC3可显著抑制LPS诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达(P<0.05，图4B)。
注：与未处理组比较，*P<0.05；
与LPS+Ad-NC组比较，#P<0.05
2.5 过表达NLRC3抑制LPS诱导的PI3K/AKT和NF-κB信号通路激活 为进一步探究NLRC3抑制BV2细胞炎症反应的分子机制，本实验检测了NLRC3对PI3K/AKT和NF-κB通路的影响。LPS处理显著上调p-AKT/AKT、p-p65/p65以及p-IκB/IκB的比值，而Ad-NLRC3显著降低了p-AKT/AKT、p-p65/p65以及p-IκB/IκB的比值，比较差异有统计学意义(均P<0.05)。见图5。
注：与未处理组比较，*P<0.05；
与LPS+Ad-NC组比较，#P<0.05
LPS是革兰阴性菌的产物，可通过激活细胞内的NF-κB、MAPK等炎症信号通路，引起小胶质细胞中TNF-α等炎症因子、NO等炎症介质的表达增加，因此被广泛用于刺激在体或体外细胞产生炎症反应[9-10]。本研究中运用LPS刺激小鼠小胶质细胞BV2建立小胶质细胞炎症模型，实验结果表明，在给予LPS刺激后，BV2细胞中PI3K/AKT与NF-κB通路被激活，NO以及炎症因子的表达量都显著提高。
NLRC3是天然免疫系统中的一种模式识别受体，能够感受外源入侵和内源性的危险信号。Karki等[11]在NLRC3-/-小鼠肠炎相关肠肿瘤模型的研究中发现，与野生型小鼠相比，NLRC3-/-小鼠局部结肠组织中的炎性细胞及炎性细胞因子(IL-lβ、IL-6与TNF等)均显著升高，免疫印迹结果显示，IκBα磷酸化水平也显著增加。Gültekin等[12]发现NLRC3通过与炎症小体复合物相互作用来负调节炎症反应。此外，据报道，NLRC3可通过减少PI3K的激活来抑制小鼠肺动脉高压炎症[13]。Schneider等[14]称，NLRC3可以减少LPS诱导的NF-κB的释放，进而抑制炎症的发生。在本研究建立的小胶质细胞炎症模型中，NLRC3的表达量显著降低，过表达NLRC3后，LPS诱导的细胞炎症反应受到抑制。
NF-κB是调控炎症反应的重要信号分子，LPS刺激可以诱导IκB磷酸化，NF-κB二聚体被释放，从胞浆转运入胞核，启动炎症相关基因的转录表达[15]。而且，大量体内体外研究表明，抑制NF-κB信号通路的激活可以有效减轻小胶质细胞的炎症反应，这可能成为帕金森病的一个潜在治疗靶点[16]。PI3K/AKT是一种参与细胞生命活动以及调节细胞功能的重要信号通路[17-18]。有报道称，LPS处理小胶质细胞可以激活PI3K/AKT通路，进一步研究发现，抑制PI3K/AKT通路的激活可以提高小胶质细胞的抗炎作用[19-20]。另外，有研究已证实NLRC3能够抑制NF-κB与PI3K/AKT信号通路，调控炎症的发生[13-14]。同样，本研究结果表明NLRC3可以抑制小胶质细胞中LPS导致的NF-κB与PI3K/AKT通路的激活。
综上所述，过表达NLRC3可通过抑制NF-κB与PI3K/AKT信号通路抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症反应，为延缓和治疗帕金森病提供了新的思路和理论依据。
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