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钱汐晶，刘燕，吴兵安，戚中田，赵平
（海军军医大学海军医学系生物医学防护教研室，上海 200433）
黄热病毒（yellow fever virus，YFV）属于黄病毒科黄病毒属，是黄热病的病原体［1-2］。作为一种重要的虫媒传播病毒，携带病毒的蚊子叮咬是其传播的主要途径，也是该病毒在灵长类动物与人类间进行传播的重要途径［3］。黄热病目前主要在南美洲和非洲撒哈拉地区流行［4］。YFV 感染后可累及人体多个脏器。患者通常表现为发热、头痛、肌肉酸痛、恶心呕吐等常见的感染症状。但大约20%～60%患者病情会进一步进展，累及到各个脏器，包括肝脾脑肾等，严重的可发展为多器官衰竭，出血性休克，甚至死亡［5-6］。尽管黄热病毒的减毒活疫苗能有效预防病毒的感染，但由于流行地区的疫苗覆盖率低，虫媒管控措施低下，且该病无有效的治疗性药物，使疫情一直在风险地区周期性暴发［7-8］。从2016年至今，黄热病多次在巴西、安哥拉等国暴发流行，致病致死率一度达到40%～60%［9-10］。目前，该病的感染范围还在不断扩大，每年感染人数高达20 万，死亡人数超过6 万［11］。我国也相继报道了11 例输入性病例。这对国内无免疫屏障的人群来说是非常大的威胁。因此，对YFV 药物的研发非常必要和迫切。
达塞布韦是丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）NS5B 的RNA 聚合酶抑制剂［12］。作为一种新型非核苷类聚合酶抑制剂，可阻断HCV RNA 的复制。临床上，达塞布韦联合其他几款直接作用的抗病毒药物（direct-acting antiviral agents，DAAs）用于治疗HCV 慢性感染的患者［13］。近期研究发现，达塞布韦还具有抑制其他虫媒病毒感染的作用。该小分子能在体外实验中抑制寨卡病毒、西尼罗病毒和森林脑炎病毒在Vero 细胞中复制［14］。然而，其在YFV 感染中的作用未见报道。通过筛选FDA 小分子药物库，我们发现达塞布韦能有效抑制YFV 感染。本研究进一步就其抗病毒效果和机制进行了初步的探索。
1.1 细胞培养和病毒扩增
人肝癌Huh7 细胞、非洲猴肾Vero 细胞购自中国科学院上海细胞所。细胞培养均使用含10%胎牛血清、2 mmol／L L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、100 U／mL 青链霉素双抗的DMEM 培养液，培养条件为37℃、5% CO2。YFV 疫苗株（YFV-17D）在Vero 细胞内进行扩增［15］。病毒感染后，待细胞出现明显病变后收集上清。病毒分装后存储在-80 ℃冰箱。病毒滴度通过空斑形成实验检测。
1.2 试剂与抗体
达塞布韦（货号：HY-13998）购自美国MCE 公司。CCK-8 细胞增殖与活性检测试剂盒购自日本同仁化学研究所。DMEM 培养基、Opti-MEM Ⅰ培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、EDTA 均购自美国Gibco 公司。小鼠Alexa Fluor®488 二抗、DAPI、TRIzol 试剂、DMSO 购自美国Invitrogen 公司。小鼠抗YFV多克隆抗体为本实验室利用甲醛灭活的YFV 全病毒免疫小鼠制备纯化获得。
1.3 CCK-8 细胞毒性检测
Huh7 细胞提前一天种于96 孔板中。第二日，将不同浓度的达塞布韦（0.04、0.2、1、5、25、125、625 μM）加入孔板中，同时以同浓度的DMSO 作为对照，继续培养24 h。检测时，将上清吸去，每孔加入浓度10%的CCK-8 试剂室温孵育1 h。随后孔板用酶标仪测定450 nm 波长处的A值，测算出不同浓度达塞布韦作用下的细胞存活情况，并计算细胞半数毒性浓度（CC50）［16］。
1.4 YFV 感染检测
Huh7 细胞提前一天种于孔板中。第二日，加入YFV（MOI=1）感染6 h。同时加入不同浓度的达塞布韦（0.04、0.2、1、5、25、125 μM）。病毒感染后24 h，分别利用免疫荧光法（IF）和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测细胞感染情况［17］。使用IF 时，将细胞用冰甲醇固定，封闭后依次加入小鼠抗YFV 多克隆抗体及抗小鼠Alexa Fluor®488 二抗。细胞核用DAPI 进行染色后，用BioTek Cytation 5 细胞成像仪分析免疫荧光检测结果，评价达塞布韦抗YFV 感染的剂效关系，并计算IC50。使用RT-qPCR 时，将细胞用TRIzol 裂解后，抽提细胞内的总RNA，逆转录后通过特异性的YFV 引物，检测细胞内YFV RNA 的表达量。引物见表1。
表1 引物序列表
1.5 YFV 感染的动力时间窗实验
Huh7 细胞提前一天种于孔板中。第二日，分别在加入病毒感染前6 h、加入病毒同时、病毒感染后6、12、18 h 加入达塞布韦（25 μM）。药物作用时间和病毒感染时间均为6 h。以相同浓度的DMSO 作为对照。病毒感染24 h 后，通过IF 检测药物在病毒感染不同时期的抗病毒效果。
1.6 YFV 复制效率的检测
构建带有NanoLuc 报告基因的YFV-17D 的复制子质粒［18］。将该质粒作为模板进行体外转录（HiScribe T7 ARCA mRNA 试剂盒）获得YFV 复制子RNA。利用LipofectamineTM2000 将RNA 转染入Huh7 细胞中，6 h 后换液。同时，加入不同浓度的达塞布韦，检测药物对病毒复制效率的影响。转染后24 h，将上清换为含有10%NanoLuc 的培养基，避光孵育5 min。利用ChemiScope 6000 成像系统对活细胞的化学发光进行测定。随后，细胞固定后再进行IF 检测。
1.7 达塞布韦与YFV NS5 亚基的亲和力检测
将YFV-17D NS5 蛋白的序列构建到了pET-32a的载体中。随后，该质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞中，并用IPTG 诱导表达蛋白。蛋白的表达和分子量大小通过电泳和考马斯亮蓝染色确定。蛋白进一步通过Ni-NTA 亲和层析柱进行纯化，并通过质谱检测。以上过程均由近岸蛋白质科技公司协助完成。
达塞布韦与NS5 亚基的相互作用通过表面等离子共振法检测，使用BIAcoreTM8K 生物分析仪。达塞布韦溶于含有5%DMSO 的PBS 中制成不同浓度的化合物溶液。首先，将纯化的病毒蛋白结合到CM5 的S 系列芯片上（美国GE 公司）。随后，分析物以30 μL／min 的流速注入［19］。记录小分子溶液的信号响应值。同时，无小分子的溶液的信号响应值作为空白对照，将从原始的数据中剔除出去。使用BIAcore 8K 评估分析软件评价小分子与蛋白间的结合动力，同时计算出KD 值［20］。
1.8 统计分析
实验结果用SPSS 20.0 软件进行分析。处理组与对照组（DMSO 组）比较采用单因素方差分析或卡方检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。
2.1 达塞布韦细胞毒性较低，能有效抑制YFV 感染
为检测达塞布韦在YFV 靶细胞中的毒性作用，我们首先检测了不同浓度药物对Huh7 细胞的影响。根据CCK-8 细胞活性检测的结果，当达塞布韦浓度达到625 μM 时，观察到明显的细胞毒性，CC50为346.1 μM（图1A）。利用不同浓度的小分子化合物处理感染细胞，发现达塞布韦能显著抑制YFV 病毒的感染，细胞内病毒RNA 的水平明显下降，病毒蛋白表达量显著降低，且呈浓度依赖的形式（图1B、1C）。经过计算达塞布韦抑制YFV 感染的IC50 为7.253 μM，其选择指数（SI 值）为47.7。
图1 达塞布韦的细胞毒性和抗YFV 活性作用
2.2 达塞布韦在YFV 感染后期阶段发挥抗病毒作用
我们进行了药物作用动力时间窗的实验，以明确达塞布韦抗病毒起效的阶段。在病毒感染的不同阶段加入化合物，观察哪个阶段对病毒感染的抑制作用最明显（图2A）。结果显示，在YFV 感染6 h 后加入达塞布韦，开始具有抗病毒的效果，并且在12～18 h加入化合物时抑制效果最为明显。在病毒感染18 h后再加入达塞布韦，抑制效果明显下降。这与病毒复制的时间段基本一致（图2B）。
图2 YFV 感染不同阶段加入达塞布韦对病毒感染的影响
2.3 达塞布韦可抑制YFV RNA 的复制效率
为了研究达塞布韦对YFV 复制的作用，我们构建了带有NanoLuc 报告基因的YFV-17D 的复制子质粒。将该质粒转染细胞后，我们用不同浓度的药物处理该细胞，检测其对YFV 复制效率的影响。结果显示，达塞布韦能显著抑制细胞内病毒RNA 的复制效率，且该抑制效果呈浓度依赖，抑制率基本与在细胞感染下观察到的一致（图3A、3B）。同时，我们还用免疫荧光法检测了细胞内病毒非结构蛋白的表达。结果提示，YFV 蛋白的表达也与病毒RNA 的抑制效果一致（图3C）。
图3 达塞布韦对YFV 复制子的抑制作用
2.4 达塞布韦通过与NS5 蛋白相互作用抑制病毒复制
在YFV 复制过程中，NS5 蛋白发挥着至关重要的作用，具有RNA 依赖的RNA 聚合酶的作用。因此，我们检测了达塞布韦与NS5 蛋白之间的相互作用。通过表面等离子共振法（SPR）BIAcore 检测发现，达塞布韦可有效与NS5 蛋白结合，KD 值为7.11 μM（图4）。此结果进一步提示，小分子化合物达塞布韦抑制病毒的复制很大可能是通过影响该蛋白的活性。
图4 达塞布韦与YFV NS5 蛋白的亲和力测定
YFV 目前仍旧在南美洲和非洲等流行地区周期性爆发［21］。作为首个发现的出血热病毒和重要的虫媒病毒，YFV 对全球的公共卫生造成了重大的压力［22］。目前，黄热病主要的控制手段就是接种疫苗和虫媒管控。但对于高发流行地区来说，这些措施可能还远远不够。研发高效、特异性靶向的抗病毒药物，能有效降低感染患者的致病致死率。达塞布韦作为一种上市的抗HCV 药物，长期在临床上运用，药物代谢、临床安全性等数据都较为明确。通过本研究发现，达塞布韦具有显著的抗YFV 感染的作用。其抗病毒活性在病毒感染后期发挥得最为明显。我们推测达塞布韦通过与YFV 复制关键的NS5 中RNA 依赖的RNA 聚合酶相互作用，影响了该酶的生物学活性，抑制了病毒的复制，从而干扰了病毒的感染。
在YFV 的生命周期中，复制是控制整个过程的关键［23］。作为复制阶段至关重要的酶，RNA 聚合酶是药物研发的重点。病毒聚合酶在各类病毒中都是最为保守的酶类之一［24］。许多病毒的治疗中都有针对聚合酶的抑制剂如HCV 治疗中的索非布韦、达塞布韦，流感病毒的治疗性药物中的法匹拉韦、巴洛沙韦，新冠病毒治疗中运用到的瑞德西韦等［25-27］。黄病毒涵盖一大类病毒，病毒间的聚合酶在结构有较大的相似性。将已上市的抗黄病毒的聚合酶抑制剂进行老药新用，发现其新的抗病毒作用，将大大缩短药物研发的周期，对于无治疗药物的新发再发传染病的治疗是理想的方法。
本研究从细胞水平上对达塞布韦抗YFV 活性进行了评价，对其主要的抗病毒阶段进行了定位，并对其涉及的抗病毒机制进行了初步探索。在本研究中，发现了达塞布韦与病毒NS5 蛋白间的相互作用。然而，该化合物与蛋白的作用位点及方式仍未确定。未来，还需进一步的实验研究对达塞布韦抗YFV 感染靶点的具体机制进行明确。同时，作为一种抗病毒药物，其体内的抗病毒活性仍旧需要全面评价。
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