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陈盈泰 吴昊 张森 李文放 王虑
脓毒症是临床急危重症患者的常见病死原因[1]。研究发现，在脓毒症的病理生理进程中，胃肠道发挥着重要作用。在严重感染情况下，致病因素造成肠黏膜屏障损害，可以使肠道微生物和内毒素迁移到肠系膜淋巴结、血液以及某些肠外脏器，发生肠源性脓毒症[2]。肠黏膜屏障结构和功能的维持主要依赖肠黏膜微循环及微血管内皮细胞结构和功能。血管结构的维持有赖于血管内皮细胞，起到分隔组织和血液的作用，防止血液里的蛋白和细胞透入血管壁[3]。血管内皮细胞的存活和增殖有赖于血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），是开启和形成新生血管过程中的重要分子。神经迁移因子Slit 及其受体Robo 蛋白属于分泌蛋白家族。研究发现，亚型Slit2 蛋白有促进人脐静脉内皮细胞迁移及体外血管生成的作用，Robo4 具有血管表达特异性，在血管新生活跃区域附近的血管内皮细胞上高表达，因此Slit2/Robo4 信号在血管新生及内皮细胞迁移过程中具有重要作用。研究发现，slit2/Robo4可以抑制血管内皮细胞迁移、成管，增加内皮细胞完整性，增强血管稳定性，减少血管通透性，从而使肠黏膜屏障得到保护[4]。本研究通过Slit2/Robo4 蛋白在脓毒症模型大鼠肠黏膜血管内皮细胞的表达及其与血管内皮生长因子的关系，探讨其维护肠黏膜微血管内皮细胞功能和保护肠黏膜屏障的机制。
1.1 动物及分组
清洁级成年健康雄性SD 大鼠16 只，体质量230～250 g，由海军军医大学实验动物中心提供（动物许可证号：Sc2k 沪2020-016）。随机分为假手术组（n=8）、脓毒症组（n=8），脓毒症组模型制备采用盲肠末端结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）法。制模前大鼠先予12 h 的禁食，不禁水。腹腔麻醉使用1%戊巴比妥溶液（30 mg/kg）。大鼠予放置仰卧位，在腹部手术部位备皮。等麻醉药物起效后，取下腹部正中切口，切开约1 cm，逐层分离直至进入腹腔，整个手术过程严格遵循无菌原则。找到并确认盲肠后，细致游离盲肠肠系膜，使用镊子将肠内容物推向盲肠远端，使用手术丝线游离盲肠总长度的50%左右，随后予以结扎。在已结扎的盲肠的游离端用针头对穿一次，同时挤出少量肠内容物。假手术组不进行盲肠结肠及穿孔操作，余操作方法同脓毒症组。24 h 后处死大鼠，用4%多聚甲醛固定实验用回肠末端组织约5 cm。
1.2 观察指标及检测方法
1.2.1 Slit2/Robo4、VEGF mRNA表达量检测 采用聚合酶联反应（polymerase chain reaction，PCR）的方法，首先进行DEPC水（DEPC处理水，基尔顿生物R1600）配置：在1 000 mL的ddH2O中加入1 mL DEPC原液，磁力搅拌器搅拌过夜。高压灭菌备用。随后进行总RNA提取，将大鼠肠组织放入1 mL的Trizol匀浆管中匀浆（电动匀浆机FLUKO PRO200）20 s，随后温育5 min，离心10 min，静止后吸取上清液，在上清液中加入600 μL异丙醇（国药集团，货号：80109218）混合均匀，室温静置15 min，4℃，12 000 r/min，离心15 min，弃上清，加入1 mL 75%无水乙醇（国药集团，货号：100092680）漂洗沉淀、静止和离心，重复一次后，弃去上清液后添加DEPC水40 μL，放入冰箱（-80℃）备用。接着进行第一条cDNA的合成，先去除总RNA中的DNA，随后进行逆转录（试剂盒购自Fermentas，货号：#K1622）。最后将制备好的cDNA进行PCR扩增（试剂盒购自Thermo，货号：#K0223）。以Primer F 5" CTTGTGCTGATGGGTTTG3"；
Primer R 5"AGTTCGCCTGTGTATTCC 3"作为上下引物扩增Slit2 mRNA，扩增大小为142 bps；
以Primer F 5" GAGGTCGGGAACTTACTGTG3"；
Primer R 5" GGAAGGAGCCATCAGAAGAG 3"为上下引物扩增Robo4 mRNA，扩增大小为148 bps；
以Primer F 5" AGACCCTGGTGGACATCTTC3"；
Primer R 5" TGTGCTGGCTTTGGTGAG 3"为上下引物扩增VEGF mRNA，扩增大小为183 bps。以Primer F 5" GGAGTCTACTGGCGTCTTCAC3"；
Primer R 5" ATGAGCCCTTCCACGATGC 3"为上下引物扩增GAPDH，扩增大小为237 bps。数据采用仪器自带软件分析：ABI Prism 7300 SDS Software。
1.2.2 Slit2/Robo4 蛋白的表达 采用Western 印迹法，首先将大鼠肠组织放入裂解液中进行裂解，随后匀浆离心（4℃，1 200 r/min，15 min），静止后取上清，蛋白质定量后保存于冰箱（-80℃）。细胞样品用PBS 液洗涤两次，离心取上清，蛋白质定量后备用。其次进行蛋白定量（BCA 蛋白定量试剂盒Thermo，PICPI23223），吸光度在波长562 nm 处测定，采用横坐标为吸光值，纵坐标为蛋白浓度（μg/μL）绘制标准曲线，然后测定样品吸光值，计算出样品实际浓度。随后选取不同的凝胶浓度制备PAGE 胶。紧接着进行上样及电泳、半干转膜、膜上蛋白检测。随后进行膜的封闭，根据说明书Slit（abcam ab134166）1∶1 000、robot（Santa Cruz sc-166872）1∶500、GAPDH（CST#5174）1∶1 000稀释抗体，制备一抗。随后稀释HRP（羊抗小鼠HRP 标记二抗：中山金桥ZB-2305；
羊抗兔HRP 标记二抗：中山金桥ZB-2301）标记的二抗，与膜同时37℃孵育1 h。用TBST 洗涤3 次，完成抗体孵育。最后进行ECL 化学发光显色（发光液：Millipore WBKLS0100），放入成像系统（Tanon Tanon-5200）进行扫描。
1.3 统计学方法
使用SPSS 20.0 软件进行数据处理，计量资料采用（）表示，组间比较采用t检验，Slit2/Robo4 蛋白表达与VEGF 表达的相关性采用Pearson 秩相关检验，以α=0.05 作为检验水准，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 Slit2 的表达量
通过PCR 及Western 实验发现Slit2 蛋白在脓毒症组及假手术组均有表达，脓毒症组蛋白表达量明显低于假手术组，差异有统计学意义[CT值：（25.51±0.33）vs.（2 4.4 3±0.2 5），t=-7.679，P＜0.001；
mRNA：（0.020±0.004）vs.（0.040±0.008），t=6.168，P＜0.001；
灰度值：（10 601.15±1 438.07）vs.（16 482.38±1 671.07），t=-5.830，P＜0.001]，见图1～4。
2.2 Robo4 的表达量
PCR及Western实验结果发现Robo4蛋白在脓毒症组及假手术组均有表达，在脓毒症组蛋白表达量明显低于假手术组，差异有统计学意义[CT值：（25.80±0.62）vs.（2 4.5 3±0.2 9），t=-4.737，P＜0.001；
mRNA：（0.016±0.004）vs.（0.037±0.006），t=8.330，P＜0.001；
灰度值：（12 206.99±129.52）vs.（20 089.75±1 535.14），t=8.462，P＜0.001]，见图1～4。
图1 slit2、robo4 蛋白Western 表达
2.3 VEGF 的表达量
同样采用PCR 的方法，实验结果发现VEGF 蛋白在脓毒症组及假手术组均有表达，在脓毒症组蛋白表达量明显高于假手术组，差异有统计学意义[CT 值：（23.81±0.35）vs.（25.34±0.31），t=13.217，P＜0.001；
mRNA：（0.064±0.018）vs.（0.021±0.003），t=-6.338，P＜0.001），见图3～4。
图2 slit2、robo4 蛋白灰度表达
图3 slit2、robo4、VEGF 蛋白CT 值
图4 slit2、robo4、VEGF 蛋白mRNA
2.4 Slit2/Robo4 与VEGF 蛋白表达量的相关性
在PCR 实验中Slit2 蛋白表达量与VEGF 蛋白表达量呈负相关（CT 值：r=-0.744，P=0.001；
mRNA 值：r=-0.688，P=0.003），Robo4 蛋白表达量与VEGF 蛋白表达量呈负相关（CT 值：r=-0.674，P=0.004；
mRNA 值：r=-0.836，P＜0.001），见表1。Slit2 蛋白表达量与Robo4 蛋白表达量呈正相关（CT 值：r=0.814，P＜0.001；
mRNA 值：r=0.805，P＜0.001），见表2。
表1 Slit2/Robo4 与VEGF 蛋白表达量之间的相关性
表2 Slit2/Robo4 蛋白表达量之间的相关性
脓毒症的病理、生理学机制复杂，涉及炎症反应、免疫调控、凝血障碍和神经/内分泌系统等[5]。肠道作为全身重要的消化吸收器官，具有丰富的微生物群体，这也是机体从感染发展到脓毒症重要因素。肠道微血管内皮结构和功能的破坏是肠源性脓毒症发生机制之一[6]。目前研究发现Slit2/Robo4 具有抑制血管内皮细胞迁移、成管，增加内皮细胞完整性，增强血管稳定性，降低血管通透性的作用[7]。研究发现Slit2/Robo4 在脓毒症模型大鼠肠黏膜微血管内皮细胞中存在表达，提示Slit2/Robo4蛋白可以保护脓毒症模型大鼠肠黏膜屏障，避免肠源性脓毒症的发生。
目前在脓毒症治疗新方法的研究中，London 等[8]研究发现Slit 蛋白对渗漏的血管具有超级黏胶样作用，从而加强机体承受其自身免疫攻击的能力。同样在袁熙等[9]研究中提示Slit 蛋白与其受体Robo 结合可以稳定血管系统，避免过度的炎症反应对正常组织的损伤。Weng 等[10]在输血相关的急性肺损伤模型研究中发现Slit2/Robo4 蛋白在肺微血管内皮细胞上有表达，且表达量明显降低。本研究发现，Slit2/Robo4 蛋白在脓毒症组及假手术组肠道血管内皮细胞上均有表达。结果显示Slit2/Robo4 蛋白表达量呈正相关，并且在脓毒症组表达量明显下降（P＜0.05），提示该蛋白参与了肠源性脓毒症的病理、生理过程，其减少原因可能存在消耗性减少。Qin 等[11]在内毒素导致的脓毒症模型研究中发现的现象与本研究结果相似，证实了本研究的结果和推测。
本研究结果显示，VEGF 在两组实验大鼠中均有表达，且在脓毒症组表达量明显增加（P＜0.05）。因为VEGF 可促进血管内皮细胞的迁移和增殖，保持内皮细胞的活性，提高血管通透性，在新生血管形成和开启过程中有着重要作用。当脓毒症发生时，血管内皮功能遭受破坏，血管通透性增加，从而发生血管渗漏。因此在脓毒症模型大鼠肠黏膜血管组织中VEGF 蛋白表达量明显增加，促进血管内皮细胞增殖和迁移，进一步加重内皮损伤，增加血管的通透性，这与本研究结果相吻合。
本研究结果还显示，Slit2/Robo4 蛋白表达量与VEGF 蛋白表达量呈负相关（P＜0.05）。相关研究发现Slit2/Robo4 在体外能抑制VGEF、FGFs 诱导的内皮细胞迁移，同时在体内可以抑制血管的新生和渗透[12]，有研究表明[13]，增生型糖尿病视网膜病变患者的血管膜中VEGF 和Robo4 共表达，Robo4 对于血管的生成起促进作用。本研究中，Robo4 蛋白表达量下降，VEGF 蛋白表达量增加，两者之间呈负相关。同样，目前有学者认为Slit2/Robo4 信号能对抗VEGF/VEGF 受体信号，血管新生及内皮细胞迁移，减少血管通透性，保持血管内平衡。因此从Slit2/Robo4 蛋白表达量呈正相关、与VEGF 蛋白表达量呈负相关这一结果，可以推断在脓毒症模型大鼠肠黏膜上存在Slit2/Robo4 蛋白抑制VEGF 所产生的血管新生、内皮迁移和血管通透性增加的作用，从而保护肠黏膜屏障功能，防止肠源性脓毒症的发生。目前已有研究证实Slit2 能降低VEGF 诱导的血管通透性上调[14]，有研究发现Slit2 蛋白依赖Robo4 发挥功能，且Robo4 通过一种非导向机制，抑制促血管生成因子诱导的新生血管芽及内皮通透性增加来维持成熟血管网的屏障功能[15]，从而佐证本研究的推断。
在下一步的研究中，拟构建脓毒症Slit2 基因敲除动物模型和人重组Slit2 组动物模型，进一步探讨Slit2/Robo4 蛋白能否通过抑制血管内皮生长因子，减少因炎症细胞因子所致的血管渗漏，保持血管系统的稳定性。同时，拟在脓毒症动物模型上检测多个时间点内Slit2/Robo4 蛋白和VEGF 蛋白的表达水平，以动态观察其变化趋势，探索其在脓毒症中的表达规律。
综上所述，通过在脓毒症模型大鼠中检测肠黏膜血管组织中Slit2/Robo4 与VEGF 的蛋白表达量，发现在脓毒症模型大鼠的肠黏膜血管组织中Slit2、Robo4 蛋白表达量明显下降，VEGF 蛋白表达量明显增加。同时Slit2/Robo4 蛋白表达量呈正相关，VEGF 蛋白表达量与Slit2/Robo4 蛋白表达量呈负相关。脓毒症模型大鼠肠黏膜血管中Slit2/Robo4 与VEGF 蛋白表达量的变化，与肠黏膜屏障系统的稳定性密切相关，这为探讨肠黏膜屏障保护机制提供了研究方向。
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