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赵亚平，董玉惠，周淑梅，陈昆，孙秀东
(1.山东农业大学园艺科学与工程学院，山东 泰安 271018；
2.山东农业大学林学院，山东 泰安 271018；
3.山东农业大学生命科学学院，山东 泰安 271018；
4.商丘市农林科学院，河南 商丘 476299)
大蒜(Allium sativumL.)是百合科葱属草本植物，具有较高营养价值和一定药用价值[1，2]，是仅次于洋葱的第二大葱属作物[3]，栽培历史悠久。联合国粮食及农业组织(FAO)2020年统计:全球大蒜种植面积约163万公顷，年产量约2 805万吨。中国是全球第一大蒜生产国，种植面积约83万公顷，年产量约2 075万吨，分别约占全球种植面积和总产量的53%和74%。大蒜在自然条件下需经历60～80 d休眠期，这会直接影响大蒜质量和市场供应期的时长，间接影响大蒜的适时、高质量、高产栽培[4]。针对该问题，前人已进行了较多相关研究，如:低温和外源激素GA3、ETH联合处理大蒜鳞芽，可使其休眠期缩短2个月[5]；
低温和外源GA3双重作用下大蒜气生鳞茎的休眠能够有效地被解除[6]；
大蒜在高温环境下休眠期可以延长[4]；
将休眠期的大蒜放在NO中熏蒸，可以促使大蒜萌发[7]；
大蒜在适宜的CO气体、温度、湿度环境下，鳞茎可以提前萌发[8]。
WUSCHEL(WUS)相关的同源异型盒(WUSCHEL-related homeobox，WOX)转录因子家族为植物所特有[9]，以植物干细胞命运的决定基因WUSCHEL来命名[10]。根据系统进化关系，该家族可以分为3支——进化支、中间支和古老支[11]，进化支包括WUS和WOX1～WOX7，中间支包括WOX8、WOX9、WOX11和WOX12，古老支包括WOX10、WOX13和WOX14。研究发现，WOX1和WOX3基因共同调控叶等器官的发育[12]；
WOX6基因调控拟南芥胚珠的发育，还具有抑制珠被细胞分化的功能[13]；
WOX7基因在侧根发育过程中发挥重要作用[14]；
WOX8基因影响拟南芥的早期发育[15]，并调控胚胎早期子叶原基发育；
WOX9基因可以促进拟南芥、矮牵牛和挪威云杉的胚胎形成和细胞增殖[15-17]；
WOX13和WOX14调控拟南芥花的发育[18]；
WOX基因可能影响大蒜鳞茎中干细胞的分化过程[19]。可见，WOX家族基因在胚的形成、干细胞稳定性和器官形成等过程中发挥着重要的调控作用。
现阶段对大蒜休眠萌发的研究主要集中在外界环境条件和激素上[20]；
虽已发现了多个与大蒜休眠萌发有关的基因如AsGA3ox、AsSAUR、As-BRI1、AsNF-YB3，但对大蒜休眠萌发的分子调控机制研究还不够深入。我们前期研究发现，WOX9基因在大蒜鳞芽休眠期和萌发期表达差异明显，推测该基因可能在调控植物休眠上发挥一定作用。因此，本研究从大蒜叶片中克隆到AsWOX9，并对其进行生物信息学分析及在不同组织器官中的表达分析，以期为深入研究AsWOX9的功能及分子作用机制提供参考。
1.1 植物材料
选用大蒜栽培品种“二水早”，2019年10月1日种植于山东农业大学试验田，2020年5月24日收获。各部位样品采集时间:2019年11月取根和叶，2020年3月取花，2020年4月取蒜薹，2020年5月取鳞茎。每个样品3次重复，液氮速冻后-80℃保存。
1.2 总RNA提取和cDNA合成
取相应的组织材料，液氮中研磨，采用TransZOL Plant(TRANSGEN)试剂盒提取总RNA，采用Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean试剂盒进行cDNA合成。引物及其序列见表1，均由上海生工生物工程股份有限公司合成。
表1 试验所用引物
1.3 AsWOX9基因的克隆
根据前期RNA-seq结果(PRJNA778905)得到AsWOX9基因序列，用DNAclub设计引物(表1)，以大蒜叶片的cDNA为模板进行扩增。PCR反应体系(40 μL):cDNA模板2 μL，2×PCR Mix 20 μL，引物各2 μL，ddH2O 14 μL。扩增程序为:94℃5 min；
94℃30 s，53℃30 s，72℃1 min，35个循环；
72℃5 min，4℃保存。产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，在紫外分析仪下确定扩增片段合适后进行切胶，利用ZOMANBIO胶回收试剂盒进行胶回收，回收基因与克隆载体pMD19-T连接，转入大肠杆菌DH5α，筛选阳性菌落交由上海生工生物工程有限公司进行测序。
1.4 AsWOX9基因的生物信息学分析
利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)对氨基酸序列组成和蛋白质理化性质进行分析；
通过PSORT Prediction(http://psort1.hgc.jp/form.html)预测蛋白在细胞中可能存在的部位；
利用SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析蛋白的信号肽序列；
利用CDD(Conserved Domain Database)分析蛋白保守结构域；
利用在线软件PRABI(http://www.prabifr/)预测蛋白的二级结构；
利用TMHMM Server V.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)进行蛋白跨膜结构域预测；
利用NCBI(https://wwwNcbi.nlmni-hgov/)在线Blast工具搜索蛋白的同源序列；
利用DNAMAN 6.0进行氨基酸多序列比对及系统进化树分析。
1.5 AsWOX9基因在大蒜不同组织中的表达分析
以Actin为内参基因，以不同组织材料的cDNA为模板，参考Biosharp公司的SYBR Green qPCR Mix试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR分析，所用引物见表1，进行3次生物学重复，采用2-ΔΔCt计算基因的相对表达水平。
2.1 AsWOX9基因的克隆
以大蒜品种“二水早”的cDNA为模板进行PCR扩增，获得570 bp条带(图1A)。将目的条带回收，与克隆载体pMD19-T连接，然后转入大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆后送样测序，结果表明，该基因包含一个570 bp的完整ORF，编码189个氨基酸(图1B)，测序结果与预期结果一致，确认扩增到正确的AsWOX9基因。
图1 AsWOX9基因PCR扩增电泳图谱(A)和氨基酸序列(B)
2.2 AsWOX9蛋白的生物信息学分析
2.2.1 氨基酸序列分析及亚细胞定位 结果表明，AsWOX9蛋白化学分子式为C939H1488N276O296S12，相对分子质量为21 764.54，等电点8.47，亲水系数为-0.833，为亲水性蛋白。该蛋白定位于细胞核中，且没有信号肽和剪切位点(图2)。
图2 信号肽NN(A)和信号肽HMM结果图(B)
2.2.2 蛋白结构分析 结果表明，AsWOX9蛋白C端存在homeobox结构域，属于homeodomain型家族基因(图3)；
由44.38%的无规则卷曲、39.05%的α-螺旋、13.02%的延伸链和3.55%的β-转角共同组成(图4A)；
没有跨膜结构，为非分泌蛋白(图4B)。
图3 AsWOX9的保守结构域
图4 AsWOX9的二级结构(A)和跨膜结构域(B)
2.2.3 AsWOX9进化树分析 经BLAST发现，WUSCHEL-related homeobox 8(芦笋)、假设蛋白CISIN_1g022516mg(橙子)、WUSCHEL-related homeobox 13 isoform X1(克莱门柚)、WUSCHEL-related homeobox 13 isoform X2(橙子)、unnamed protein product(沙生拟南芥)与AsWOX9同源性较高，平均同源相似率60.84%(图5A)。为进一步研究上述蛋白之间的亲缘关系，构建系统发育进化树，结果(图5B)显示AsWOX9与芦笋的WUSCHEL-related homeobox 8亲缘关系最近。
图5 AsWOX9蛋白的氨基酸序列比对结果(A)和进化树分析(B)
2.3 AsWOX9基因在大蒜不同器官中的表达分析
采用qRT-PCR对AsWOX9基因在大蒜不同器官中的表达进行测定分析，结果(图6)表明，该基因在大蒜不同组织器官中均有表达，表达量在叶中最高，根中次之，然后依次为蒜薹、花、鳞茎；
根中的表达量分别是鳞茎、蒜薹表达量的14倍、2.4倍。
图6 AsWOX9基因在大蒜不同器官中的表达
WOX转录因子家族在植物的生长发育中起着重要的调控作用[21-23]，通过本身特有的结构域与相应的顺式元件相互作用来调控基因的表达[24]，如水稻的OsWOX11可以响应生长素和细胞分裂素细胞信号，并且可以调控细胞分裂素应答基因RR2来控制冠根发育过程中的细胞增殖[25]。但有关该家族基因在植物休眠调控中作用的研究报道还很少，作用机制尚不清楚。郑佳[26]研究发现，WOX4基因在杨树由生态休眠向内休眠转化、形成层恢复活动初期及形成层旺盛活动末期表达量明显上调。我们前期研究发现转大蒜WOX基因有利于打破拟南芥种子休眠，促进萌发。本研究从大蒜叶片中克隆了AsWOX9基因，经生物信息学分析，其编码的蛋白为亲水性非分泌蛋白，无信号肽和剪切位点，具有典型的homeobox结构域，亚细胞定位于细胞核，与芦笋的WUSCHEL-related homeobox 8蛋白亲缘关系最近；
基因表达分析结果显示，AsWOX9基因在大蒜的多个组织部位均有表达，以叶中表达量最高，根中次之，鳞茎中最低。本研究结果可为深入探究AsWOX9基因的功能及分子机理奠定基础。
