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张钰坤 原阳 卢琦 邹林峰 高远真 邢东明,3
(1 青岛大学基础医学院，山东 青岛 266071；
2 青岛大学附属医院肿瘤研究所，青岛肿瘤研究院；
3 清华大学生命科学学院)
目前包括阿霉素(Dox)在内的蒽环类药物是乳腺癌等多种肿瘤的常用化疗药物[1-2]，但其导致的心脏毒性发生率高达30%[3]，是肿瘤患者死亡的重要因素之一[4]。迄今为止，右雷佐生(Dexra)是唯一被FDA批准的蒽环类药物中用于化疗的心脏保护药物，但仍有严重的骨髓抑制等副作用[5-6]。因此，研发更加有效且副作用小的新型心脏保护药物有重要临床意义。线粒体功能障碍和活性氧(ROS)大量释放是Dox诱导心脏毒性发生的主要机制[7-8]，恢复心肌细胞内线粒体功能和降低氧化损伤可缓解Dox引起的心肌毒性。5-羟基色氨酸(5-HTP)是自非洲加纳谷物Griffoniasimplicifolia种子中提取的天然氨基酸类物质[9]，临床上用作抗抑郁药物。目前研究表明，5-HTP能够增强心肌收缩力，同时5-HTP是比维生素C更为有效的抗氧化剂[10-11]。而目前5-HTP对Dox引发的心脏损伤是否有保护作用尚不清楚。本研究以Dexra作为阳性药物，以Dox诱发的小鼠急性心肌损伤和H9c2心肌细胞损伤为模型，研究5-HTP对Dox诱导心肌损伤的保护作用及可能机制。
1.1 材料与试剂
SPF级雌性C57BL/6J小鼠共计32只(8周龄，18～22 g)，购自北京斯贝福生物技术有限公司。H9c2大鼠心肌细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司。Dox与Dexra购自湖北威德利化学科技有限公司，5-HTP购自西安恩肽元生物科技有限公司。CCK-8试剂，线粒体膜电位试剂盒、HE染色试剂盒及Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒均购自大连美仑生物技术有限公司，三磷酸腺苷(ATP)检测试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒及DCFH-DA探针购买于北京索莱宝科技有限公司，心肌肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒、小G蛋白Rho相关激酶1(Rock-1)、核因子E2相关因子2(Nrf-2)、沉默调节蛋白1(Sirt-1)及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)兔源抗体购自武汉爱博泰克生物技术有限公司。
1.2 H9c2细胞培养及5-HTP浓度的确定
H9c2细胞培养于含体积分数0.10的胎牛血清以及10 g/L的青霉素链霉素双抗的DMEM完全培养基中，置于37 ℃恒温恒湿且含体积分数0.05 CO2的培养箱中培养，待细胞生长密度达到70%～80%时进行后续实验。
将H9c2细胞以每孔10 000个细胞的密度接种于96孔板中，待细胞融合度达到80%后，分别加入10、20、50、100 μmol/L 5-HTP与5 μmol/L Dox的混合液，处理24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂于37 ℃孵育2 h，使用酶标仪测定波长450 nm处吸光度值。计算不同浓度药物处理后的细胞存活率，选取细胞存活率最高时的5-HTP浓度用于后续实验。每组设置5个复孔，结果取均值。
1.3 H9c2细胞分组及各项指标检测
当H9c2细胞融合度约达80%时，使用胰酶消化细胞，接种于6孔板中，待细胞生长密度再次达到80%后，将细胞分为4组：对照组(不处理)、模型组(培养液中加入Dox 5 μmol/L)、阳性药物保护组(培养液中加Dox 5 μmol/L+Dexra 20 μmol/L)以及5-HTP保护组(培养液中加入Dox 5 μmol/L+5-HTP 20 μmol/L)，处理24 h后，取各组细胞用于后续检测。
严格按照各试剂盒说明书操作要求，使用LDH检测试剂盒测定各组细胞培养基中LDH的漏出量，分别使用ATP检测试剂盒和SOD检测试剂盒检测细胞内ATP的水平及SOD活性，使用酶标仪分别测定波长340 nm与560 nm处的吸光度值。按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒说明书的要求，用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，探针孵育15 min后，使用流式细胞术检测细胞凋亡率，细胞凋亡率为Annexin V-FITC阳性的细胞占比。用20 μmol/L DCFH-DA探针孵育细胞20 min，在荧光显微镜下随机选取5个视野拍照，采用Image J 软件分析平均荧光强度。同时按照说明书要求使用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位，荧光显微镜下观察红色荧光和绿色荧光，采用Image J 软件分析红绿荧光强度，以红绿荧光比值表示线粒体膜电位。上述实验均重复3次，结果取均值。
1.4 以Western Blot方法检测H9c2心肌细胞中Rock-1、Nrf-2、Sirt-1及Bcl-2蛋白表达水平
各组细胞于10 cm培养皿中培养至生长密度达70%～80%时，药物处理24 h后，以预冷PBS清洗，使用加入蛋白酶抑制剂裂解液裂解细胞，提取细胞内总蛋白。取等量蛋白上样，经SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移至PVDF膜上，以50 g/L脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入兔源Rock-1、Nrf-2、Sirt-1、Bcl-2一抗(1∶1 000)和内参GAPDH(1∶5 000)，4 ℃孵育过夜；
TBST洗去残留的一抗，二抗(1∶10 000)室温孵育1 h，滴加超敏型化学发光检测试剂显色，凝胶成像仪显影，采用Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以Rock-1、Nrf-2、Sirt-1及Bcl-2蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值表示各蛋白的相对表达水平。实验重复3次，结果取均值。
1.5 动物实验及相关指标检测
32只C57BL/6J小鼠随机分为4组，每组8只，对照组小鼠每天灌胃200 μL生理盐水，模型组、阳性药物保护组和5-HTP保护组小鼠均于实验第1天腹腔注射10 mg/kg Dox，仅注射1次，同时阳性药物保护组小鼠再每天经腹腔注射14.3 mg/kg Dexra，5-HTP保护组小鼠再每天灌服30 mg/kg的5-HTP，连续1周。处理1周后，所有小鼠用含体积分数0.015的异氟烷进行气体麻醉，采用飞依诺多普勒超声诊断仪V6检测小鼠心功能(探头频率为23 MHz)，测定左心室射血分数(EF%)和短轴缩短率(FS%)。参照试剂盒说明书使用ELISA法测定小鼠血清中心肌肌钙蛋白I(cTnI)的水平。心脏超声检查完成后，每只小鼠腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠10 μL/g麻醉，后脱臼处死，取心脏组织石蜡包埋，组织切片进行HE染色，于显微镜下观察心脏组织病理学变化。使用Trizol试剂提取对照组、模型组以及5-HTP保护组3组小鼠心脏组织总RNA，通过RT-qPCR法检测心肌组织中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(Casp1)、Casp2、B淋巴细胞瘤-2关联X(Bax)及B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子(Bad)的mRNA表达水平。引物名称及其序列见表1。
表1 引物名称及其序列Tab.1 Primer names and sequences
1.6 统计学方法
2.1 5-HTP实验浓度的确定
CCK-8实验结果显示，H9c2细胞经10、20、50、100 μmol/L 5-HTP与5 μmol/L Dox的混合液处理24 h以后，细胞存活率分别为(52.78±2.55)%、(72.84±1.88)%、(72.52±3.21)%、(68.77±3.84)%，各组间比较差异有显著性(F=96.88，P<0.05),其中20 μmol/L 5-HTP与5 μmol/L Dox混合液处理后的细胞存活率最高，故确定20 μmol/L为后续5-HTP的实验浓度。
2.2 5-HTP对Dox诱导的H9c2心肌细胞各项指标的影响
单因素方差分析显示，各组H9c2细胞培养基中LDH漏出量、各组细胞的细胞凋亡率以及细胞内ROS水平、SOD活性、线粒体膜电位、ATP水平及Bcl-2、Sirt-1、Nrf-2、Rock-1蛋白表达水平比较，差异均有显著性(F=17.15～238.27，P<0.05)。其中，对照组、5-HTP保护组的上述各项指标与模型组相比，差异均有显著性(P<0.05)；
阳性药物保护组细胞内的ROS水平、细胞凋亡率、ATP水平、Sirt-1蛋白表达水平及培养基内LDH漏出量与模型组相比，差异有显著性(P<0.05)；
阳性药物保护组细胞内的ROS水平、SOD活性、线粒体膜电位及Bcl-2、Nrf-2、Rock-1蛋白表达水平与5-HTP保护组相比，差异有显著性(P<0.05)，阳性药物保护组和5-HTP保护组的其余指标比较差异均无显著性(P>0.05)。见表2。
表2 5-HTP对Dox诱导的H9c2心肌细胞各项指标的影响Tab.2 Effect of 5-HTP on various indices of Dox-induced H9c2 cardiomyocytes
2.3 5-HTP对小鼠心功能以及心脏组织形态学的影响
小鼠心脏超声检测结果显示，对照组、模型组、阳性药物保护组、5-HTP保护组小鼠的EF%分别为(84.22±2.94)%、(59.72±8.67)%、(75.26±2.52)%、(86.90±1.03)%，FS%分别为(48.68±4.71)%、(27.40±7.84)%、(41.66±7.50)%、(51.58±7.89)%，血清中cTnI水平分别为(152.20±12.30)、(505.60±18.31)、(365.00±21.14)、(372.00±18.91)ng/L，各组小鼠EF%、FS%以及血清cTnI水平比较，差异均具有显著统计学意义(F=6.91～59.69，P<0.05)，其中，对照组、阳性药物保护组以及5-HTP保护组与模型组小鼠的上述指标比较，差异有显著统计学意义(P<0.05)，阳性药物保护组与5-HTP保护组上述指标比较，差异无显著统计学意义(P>0.05)。
HE染色结果显示，模型组与对照组比较，心肌细胞排列间隙变大，心肌细胞周围可见炎性细胞浸润，而阳性药物保护组、5-HTP保护组与模型组相比，心肌细胞排列间隙减小，炎性浸润情况减轻。阳性药物保护组与5-HTP保护组间心肌组织形态学无明显差异。见图1。
A:对照组，B:模型组，C:阳性药物保护组，D:5-HTP保护组，400倍
2.4 5-HTP对小鼠心脏组织中凋亡相关基因表达的影响
RT-qPCR结果显示，对照组、模型组、5-HTP保护组小鼠心脏组中Casp1 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.16、1.3±0.05、0.98±0.11，Casp2 mRNA的相对表达水平分别为1.00±0.04、1.27±0.07、0.95±0.04，Bax相对表达水平分别为1.00±0.07、1.19±0.10、0.86±0.06，BadmRNA的相对表达水平分别为1.00±0.05、1.23±0.10、1.13±0.06，各组间上述凋亡相关基因相对表达水平比较差异有显著意义(F=7.30～29.67，P<0.05)，其中，对照组、5-HTP保护组Casp1、Casp2、Bax及BadmRNA的相对表达水平与模型组相比，差异均有显著统计学意义(P<0.05)。
蒽环类药物是乳腺癌辅助治疗中常用的化疗药物[2,6]，然而包括Dox在内的蒽环类药物对心脏有严重的副作用，而且还有剂量依赖性[4]，Dexra作为唯一被FDA认可的对蒽环类药物心脏毒性有保护作用的药物，也有着严重的骨髓抑制副作用[5-6]，因此探索与开发安全有效的心脏保护药物对提高癌症患者的生存质量很有必要。
研究表明氧化应激是Dox引起心脏毒性和心肌细胞死亡的主要因素[12-13]，ROS的大量积累会导致细胞线粒体中ATP合成中断[12]，反之，线粒体功能受损，心肌细胞能量代谢异常，也会促使线粒体释放过多ROS，细胞内氧自由基生成增多，氧化应激水平失衡，诱发细胞凋亡[14]。
本研究首先采用10、20、50、100 μmol/L浓度的5-HTP与5 μmol/L Dox共同处理H9c2细胞，使用CCK-8法检测细胞存活率，确定20 μmol/L的5-HTP是保护作用最强的浓度，作为后续实验的使用浓度。进一步针对氧化应激和线粒体功能相关指标进行检测，结果显示，5-HTP能降低H9c2细胞LDH的过度释放，缓解细胞凋亡，表明5-HTP对Dox引起的心肌细胞损伤与凋亡表现出良好的抑制作用，可减少细胞膜破损。进一步研究显示，5-HTP能够恢复H9c2细胞的线粒体膜电位并提升细胞内ATP水平与SOD的活性、降低ROS水平，这提示5-HTP可通过调控线粒体功能恢复细胞内能量代谢，进而缓解由线粒体损伤引发的细胞过度氧化应激与凋亡，且5-HTP保护组的ROS水平、SOD活性、线粒体膜电位及Nrf-2、Rock-1蛋白表达水平与阳性药物保护组相比差异有显著性，推测5-HTP在缓解心肌细胞线粒体损伤和氧化应激方面的效果略优于阳性药物Dexra。多项研究表明褪黑素可通过降低心肌细胞内氧化应激水平而缓解Dox诱发的心肌损伤[15-16]，而5-HTP代谢的下游产物即为褪黑素[10,17]。有研究表明，5-HTP是比褪黑素和维生素C更有效的自由基清除剂[10-11]。从分子结构上来讲，5-HTP有理想的氧化还原特性，其杂原子环结构使吲哚胺能够作为电子供体发挥抗氧化作用[11]。本研究中5-HTP能够降低Dox诱发的较高的心肌细胞氧化应激的水平，可能与其所具有的强大的自由基清除活性有关。
本研究中通过Western Blot实验的结果发现，5-HTP保护组与模型组相比，细胞内Sirt-1、Nrf-2和Rock-1蛋白的表达水平显著上升，提示5-HTP通过上调这3种蛋白的表达发挥保护作用。Sirt-1蛋白可参与调节细胞能量代谢、线粒体功能、氧化应激和细胞凋亡等，通过激活Nrf-2蛋白来预防Dox所致的氧化应激和细胞凋亡[18-19]。另有研究表明，Nrf-2蛋白的下调会使RhoA/Rock信号通路受到抑制，Rock-1蛋白表达下降，导致细胞增殖受到抑制[20-21]。5-HTP能够显著改善Dox引起的Sirt-1蛋白表达降低，进而改善线粒体功能及抑制细胞凋亡。Dox诱导的心肌病中主要表现为心肌细胞内Nrf-2缺乏，Nrf-2可控制细胞中氧化应激的内源性抑制因子[22-23]。本研究结果显示，5-HTP能显著提高Nrf-2蛋白的表达水平，并激活Rock-1蛋白，提示5-HTP可通过上调细胞内Sirt-1和Nrf-2的水平，减轻氧化应激水平，以利于线粒体功能恢复。此外，通过增强Rock-1蛋白表达促进细胞增殖，减少细胞凋亡，缓解心脏毒性。
5-HTP是5-HT的前体化合物，是心脏中合成5-HT的关键因子。有研究表明，5-HTP在心肌细胞中发挥正性肌力及变时性作用的原因是5-HTP在心肌细胞内转化为了5-HT[17]，所以在本研究中5-HTP保护组能缓解Dox引发的小鼠心功能障碍以及降低心肌损伤标记物cTnI水平，可能是由于5-HTP在心脏中被转化为5-HT而发挥作用。此外，注射Dox引起的过度氧化应激及线粒体损伤会引发细胞凋亡[24-25]。本研究中，细胞凋亡相关基因Casp1、Casp2、Bax与Bad的表达水平在模型组小鼠心脏组织中均显著上调，而5-HTP保护组中上述基因的表达下降，提示5-HTP可缓解Dox诱导的细胞凋亡进而缓解心脏毒性。
综上所述，本研究发现5-HTP在H9c2心肌细胞及C57BL/6J小鼠中对Dox诱导的心肌毒性均有保护作用。该保护作用可能与通过调控H9c2心肌细胞内Sirt-1/Nrf-2/Rock-1信号通路进而恢复线粒体功能，抑制细胞内氧化应激水平及细胞凋亡有关。因此，5-HTP有潜力作为一种新的候选药物治疗Dox诱发的心脏毒性。
利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。
ConflictsofInterest：
All authors disclose no relevant conflicts of interest.
伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学实验动物福利伦理委员会的审核批准(文件号20211202C57-7620211217068)。所有实验过程均遵照美国国立卫生院出版的《实验动物合理和使用指南》的条例进行。
EthicsApprovalandAnimalRight：
All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Experimental Animal Welfare Ethics Committee of Qingdao University (Approval Letter No. 20211202C577620211217068), and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of the Care and Use of Laboratory Animals published by the National Institutes of Health.
作者贡献：张钰坤、原阳、卢琦及高远真参与了研究设计；
张钰坤、原阳、邹林峰及邢东明参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。
Contributions：
The study was designed byZHANGYukun,YUANYang,LUQi, andGAOYuanzhen. The manuscript was drafted and revised byZHANGYukun,YUANYang,ZOULinfeng, andXINGDongming.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.
