【www.zhangdahai.com--其他范文】
庞星一，王 贺
(北华大学附属医院，吉林 吉林 132011)
胶质瘤是最常见的起源于神经外胚层的颅内肿瘤，根据世界卫生组织(WHO)的分类标准，按恶性肿瘤的病理特征将胶质瘤分为4类(Ⅰ～Ⅳ型)[1].胶质瘤是一类发病率高、生存率低的肿瘤[2]，临床治疗方式主要有手术切除、放疗、化疗、中医药治疗和基因治疗[3].由于其侵袭性、对传统化疗的耐药和较高的复发率，仍有较高的死亡率[4].因此，探索胶质瘤的分子机制及诊断胶质瘤的标志物具有重要意义.
自噬是细胞内部进化高度保守的代谢过程，自噬的激活有助于细胞维持内部稳态，降解错误折叠的蛋白并消化损伤的细胞器(包括线粒体等)，降解后的营养物质被细胞重新利用，以获得生长代谢所需的能量.肿瘤细胞由于自噬的高代谢水平、高能量需求及无氧酵解等异常生命过程，对肿瘤细胞的生长过程至关重要.有研究[5-7]发现：胶质瘤细胞自噬的激活有助于其对临床药物的抵抗，并广泛参与细胞生长和转移.但自噬在胶质瘤中的调控机制尚不明确，有研究[8]发现：长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)广泛参与自噬的调控过程，例如，长链非编码RNA ATB能通过自噬相关基因5(ATG5)促进自噬的发生，并促进肿瘤的增殖.因此，进一步探索lncRNA与胶质瘤细胞自噬的关系及其机制至关重要.自噬相关基因(autophagy-related genes ATGs)是自噬过程中的关键分子标志物，包括ATG3、ATG5、ATG7等，它们共同参与自噬的激活、自噬小体的形成和延伸，并可接受多种lncRNAs的调控进而参与细胞自噬过程[5].
LncRNA CASC15 (long non-coding RNA cancer susceptibility 15) 是一种新型长链非编码RNA，有研究[9]发现其可促进胶质瘤细胞生长和迁移，但其在胶质瘤中与自噬之间的调控关系尚不清楚.本研究旨在探索胶质瘤中lncRNA CASC15 对胶质瘤细胞自噬的调控方式.
1.1 细胞培养
人胶质瘤细胞株(U251、A172、U87和SHG44，中科院上海细胞库)；
正常人星形胶质细胞HEB细胞株(ATCC0459，上海雅吉生物科技有限公司)；
应用RPMI-1640 (安诺伦生物科技有限公司)+10%胎牛血清(FBS，安诺伦生物科技有限公司)在37 ℃、5 % CO2的培养箱中培养细胞，并加入100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素(Gibco公司，美国).细胞生长融合度达到80%时对细胞进行1∶3传代，1次/2 d常规换液.
1.2 质粒转染
CASC15的过表达序列和阴性对照空白载体由上海吉玛制药技术有限公司合成.细胞种植于培养皿中，待细胞融合度达到60%时进行质粒转染.质粒转染使用无血清Opti-MEM培养基，转染过程使用Lipofectamine 3000试剂盒(invitrogen)，P3000作为辅助试剂同时使用，转染过程严格按照说明书流程进行.待转染试剂加入6 h后进行一次常规换液.
1.3 细胞增殖实验(CCK8实验)
应用CCK8法检测人胶质瘤细胞的增殖能力，分别向96孔板中加入U251和U87细胞系，每孔中放入2 000个细胞(以血细胞计数器进行计数)，24、36、48 h后使用CCK8试剂盒(上海碧云天生物技术公司)进行细胞增殖检测，20 min后在450 nm处检测吸光度值.
1.4 PCR实验
细胞转染pcDNA3.1或者pcDNA3.1-CASC15后，使用Trizol试剂进行总RNA提取(Invitrogen).在EP管中，按照每1 mL Trizol加0.2 mL氯仿的量加入氯仿(即为1/5体积)，随后按照每1 mL Trizol加0.5 mL异丙醇的量加入异丙醇(即为1/2体积)，4 ℃静置20 min，沉淀RNA并使用乙醇进行洗涤.通过PrimeScript RT reagent kit(Takara)进行反转录，SYBR-Green(Takara)进行最后的qRT-PCR分析.实验全部操作3次以上，18S作为内参，使用2-ΔΔCt方法进行计算.引物：CASC15-F：5′-CACA CGCATGGAAAACCCAG-3′；
CASC15-R：5′-GAGGA CCTGAGCTGTAAGCC-3′；
ATG3-F：5′-GTCCACCA CTGTCCAA-3′；
ATG3-R：5′-GCTTCCGTTATTCC TG-3′；
ATG5-F：5′-AAAGATGTGCTTCGAGATGTGT-3′；
ATG5-R：5′-CACTTTGTCAGTTACCAACGTCA-3′；
AT G7-F：5′-GAACAAGCAGCAAATGA-3′；
ATG7-R：5′- GACAGAGGGCAGGATAG-3′；
18s-F：5′- GAAACGGC TACCACATCC-3′；
18s-R：5′-ACCAGACT TGCCCTC CA-3′.
1.5 Western blot实验
取培养板中的细胞，滴加RIPA细胞裂解液(碧云天生物科技有限公司)提取细胞总蛋白；
使用8%～12%的分离胶(索莱宝生物科技有限公司)分离蛋白，湿法转至PVDF膜上，再使用5%的脱脂牛奶封闭1.5 h；
滴加一抗(1∶1 000)(LC3、ATG3、β-actin；
Abcam)，4 ℃孵育过夜；
第2天，滴加二抗(1∶10 000，Abcam)，室温下孵育1.5 h，TBST清洗3次，每次5 min；
随后进行发光检测.
1.6 生物信息分析
临床样本基因表达数据获取自TCGA数据库(https：∥www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga).正常样本数据获取自GTEx数据库(https：∥www.genome.gov/Funded-Programs-Projects/Genotype-Tissue-Expression-Project).
1.7 统计学分析
2.1 LncRNA CASC15在胶质瘤组织和细胞中高表达
为探究CASC15在胶质瘤组织中的表达情况，本研究分析了TCGA数据中胶质瘤组织和GTEx数据库中正常组织CASC15的表达差异(见图1 a)，结果发现，在胶质瘤组织中CASC15表达明显增高(P=0.032).这说明CASC15在胶质瘤中有可能参与其发生和发展，并有可能成为一个恶性肿瘤的诊断基因.为进一步探索其异常表达的情况，本研究通过实时定量PCR技术检测了几种常见胶质瘤细胞系中CASC15的表达情况(见图1 b)，发现其在胶质瘤细胞系中的表达也呈现不同程度的增加(U251：P=0.018；
U87：P=0.024；
A172：P=0.011；
SHG44：P=0.048).这些结果说明CASC15在胶质瘤的发生发展中可能发挥重要作用.
*.P<0.05.a.利用TCGA数据库和GTEx数据库分析胶质瘤组织中CASC15的表达(Tumor：肿瘤组织；
Normal：正常组织)，肿瘤组织样本163例，正常组织样本207例.b.CASC15在不同胶质瘤细胞株中的表达，HEB细胞系作为正常对照组.
2.2 LncRNA CASC15 促进胶质瘤细胞的生长
为进一步探究CASC15对胶质瘤细胞生长能力的影响，我们通过转染技术过表达CASC15，构建CASC15过表达的胶质瘤细胞系，并检测了转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-CASC15后CASC15的表达情况(见图2 a和2 b).转染后，CASC15表达分别提高了178倍和97倍(U251：P<0.001；
U87：P<0.001)，这说明过表达细胞系的构建成功.随后，为进一步探究CASC15对于胶质瘤细胞的功能学调控能力，我们使用过表达细胞系进行了CCK8实验，以评估CASC15对于胶质瘤细胞生长能力的影响(见图2 c和2 d).结果发现：过表达CASC15后，从36 h开始，胶质瘤细胞生长能力明显增加(U251：P=0.041和U87：P=0.008)，这说明CASC15在胶质瘤组织中的异常表达是具有病理性意义的，其参与胶质瘤细胞的生长过程.
*.P<0.05；
**.P<0.01；
***.P<0.001.a.U251细胞转染pcDNA3.1 CASC15后PCR检测其表达情况；
b.U87细胞转染pcDNA3.1 CASC15后PCR检测其表达情况；
c.CASC15对U87细胞株胶质瘤细胞生长能力的影响，PBS为空白对照；
d.CASC15对U87细胞株胶质瘤细胞生长能力的影响.
2.3 LncRNA CASC15 促进了胶质瘤细胞的自噬
自噬是细胞自我保护机制的一种方式，可有效提高自噬可缓解外界应激压力，促进细胞生存，因此，我们拟进一步探索CASC15对于胶质瘤细胞自噬水平的调控作用.使用CASC15过表达细胞系通过Western blot实验进行LC3和P62表达检测，并进行量化分析(见图3 a和3 b).结果显示：在两种胶质瘤细胞系中，过表达CASC15增加了LC3II/LC3I的比值(U251：P=0.004和U87：P=0.029)，并且抑制了P62蛋白表达(U251：P=0.021和U87：P=0.027).结果表明，CASC15可有效提高胶质瘤细胞的自噬.
*.P<0.05；
**.P<0.01.a.过表达CASC15后U251细胞LC3II/LC3I的比例和P62表达及相关定量分析；
b.过表达CASC15后U87细胞LC3II/LC3I的表达、P62表达及相关定量分析.
2.4 CASC15通过ATG3促进胶质瘤细胞自噬
为进一步探索CASC15在胶质瘤细胞中的自噬调控机制，我们使用PCR对CASC15过表达细胞系进行了ATGs的表达检测，分析CASC15对于胶质瘤细胞ATG3、ATG5及ATG7的调控关系(图4 a、b).结果显示：过表达CASC15后，U251和U87细胞系ATG3 mRNA的表达显著提高(P=0.041).通过蛋白印迹实验检测了ATG3的蛋白表达情况(图4 c、d)，结果显示：过表达CASC15可明显提高ATG3的蛋白表达(P=0.028).
*.P<0.05.a.U251胶质瘤细胞系过表达CASC15后ATGs的mRNA表达情况；
b：U87胶质瘤细胞系过表达CASC15后ATGs的mRNA表达情况；
c.Western blot检测过表达CASC15后U251细胞系中ATG3、ATG5以及ATG7的蛋白表达情况；
d.Western blot检测过表达CASC15后U87细胞系中ATG3、ATG5以及ATG7的蛋白表达.
胶质瘤是恶性程度极高的神经系统肿瘤，其发病率高，且预后较差[2，10].目前，治疗脑部胶质瘤的主要方式为放疗、化疗、中药治疗以及基因治疗等.但现在的治疗方法存在很多局限性，如很多患者会产生耐药性并且对耐药的患者缺乏有效的新的治疗措施，难以有效解决问题[11].因此，积极探索肿瘤治疗的新途径，开发潜在的治疗靶点已迫在眉睫.本研究通过组织样本数据库，比对了CASC15在病理组织与生理组织中的表达差异，并通过胶质瘤体外细胞系检测了CASC15的表达，明确了CASC15在胶质瘤中异常表达上调，随后，通过Western blot、PCR等实验共同评估了CASC15对细胞自噬的影响，明确了CASC15在肿瘤致病过程中的一个关键调节过程.
自噬是一种进化保守的细胞内降解过程，自噬的适度激活有助于细胞在应激状态下维持自我稳态.自噬也是一种重要的胞内代谢过程，已被证明是许多肿瘤发生发展过程中的关键环节，LC3Ⅱ作为自噬小体闭合过程中的关键分子，其与LC3Ⅰ的转化程度已经成为评估自噬流的标记性蛋白，而p62作为自噬蛋白，与LC3Ⅱ共同成为自噬流的重要评估分子[12-13].许多研究[14-15]表明，自噬在包括神经胶质瘤在内的多类别人类癌症中发挥了重要作用，如toll样受体2 (toll-like receptor 2，TLR2)可通过增强自噬促进胶质瘤的发展和进展.TGF-β2通过Smad途径启动自噬，促进胶质瘤细胞侵袭.此外，越来越多的研究[14]也显示，自噬广泛参与胶质母细胞瘤的化疗耐药过程和放疗抵抗过程.如T-LAK细胞起源蛋白激酶可通过磷酸化ULK1抑制自噬，促进胶质瘤细胞对替莫唑胺的耐药性[16-17].LncRNA是一类具有多种功能的非编码RNA，最常见的途径是通过抑制miRNA的表达进而导致mRNA的上调[17].研究[3]发现，lncPVT1可以通过miR-128-3p/Gremlin 1(GREM1)促进肿瘤的发生和进展，然而目前长链非编码RNA与自噬的调节机制仍然受到关注.作为一个动态过程，非编码RNA如何参与自噬小体的发生、形成乃至成熟仍然需要进一步的探索.
本研究以临床样本数据为基础，首先评估了CASC15在肿瘤组织与正常组织表达差异，然后通过细胞系进行了验证，并根据CCK8实验对其生长能力进行了检测，发现CASC15能够促进胶质瘤细胞增殖能力.随后通过Western blot对胶质瘤细胞自噬过程进行了评估，发现其过表达后可明显促进胶质瘤细胞自噬.在自噬的调节过程中，ATGs是自噬的关键调节因子，因此，通过PCR实验对几种常见的自噬相关蛋白mRNA进行了检测，发现其中自噬相关蛋白ATG3差异明显.因此，我们进一步通过Western blot实验对ATG3表达进行了评估，发现CASC15过表达后增加了ATG3蛋白表达，但ATG5以及ATG7蛋白表达变化无明显差异，这与PCR实验结论一致.本研究结果显示，ATG3作为自噬过程中的关键调节因子，是CASC15诱导自噬的一个关键作用位点，CASC15通过调控蛋白翻译影响ATG3的表达，从而调控自噬通量.
综上所述，本研究通过多项基础实验并结合公共数据库探索了CASC15调控自噬的新机制，为未来基因靶向治疗提供了理论基础.
猜你喜欢 细胞系胶质瘤调控 长链非编码RNA在胶质瘤中的研究进展临床神经外科杂志(2022年6期)2022-11-14成人高级别脑胶质瘤术后复发相关因素分析中国现代医生(2022年19期)2022-08-25mi RNA-221沉默对脑胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的影响临床医学工程(2022年7期)2022-08-01楼市调控是否放松理财周刊(2022年4期)2022-04-30miR-142-5p通过CCND1调控胆囊癌细胞的增殖和转移昆明医科大学学报(2022年2期)2022-03-29POU3F2在胶质瘤中的表达及其临床意义临床外科杂志(2022年2期)2022-03-23碘-125粒子调控微小RNA-193b-5p抑制胃癌的增殖和侵袭昆明医科大学学报(2022年1期)2022-02-28动物细胞培养技术研究现状与思考科学与生活(2021年16期)2021-11-25去泛素化酶OTUD3调控胆固醇酯化酶SOAT1蛋白稳定性的机制青岛大学学报（医学版）(2021年5期)2021-11-17如何调控困意学苑创造·A版(2020年12期)2020-01-07本文来源：http://www.zhangdahai.com/shiyongfanwen/qitafanwen/2023/0427/590021.html
