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李雪,王淳,王静,程瑞明,赵金满,韩馨悦,张志东
(1河北农业大学 林学院，河北 保定 071000；
2河北省林木种质资源与森林保护重点实验室,河北 保定 071000)
凋落叶是林木生长发育过程的代谢产物，是林地有机质的主要来源。凋落叶分解对于维持土壤肥力、植物生长和生态系统的养分循环等具有重要作用[1]。凋落叶分解为物理过程和生物化学过程[2-3]。分解初期，受淋溶作用的影响，氮、磷等元素快速损失，淋溶作用主要是将有机盐、蛋白质等可溶性物质释放出来，对于木质素等难溶解的物质影响不大。微生物能够直接参与凋落叶的分解过程，如氧化、氨化、固氮等过程。凋落叶的碳、氮、磷等养分元素给微生物提供食物，微生物的代谢活动反过来会影响凋落叶的分解。在微生物参与的分解阶段，氮、磷等营养元素难以满足微生物的需要，因此，微生物会固定氮、磷等营养元素[4]。微生物的群落结构会随着分解时间的变化而改变[5]。易分解的物质在分解初期被大量分解，微生物可利用的物质减少，从而引起微生物群落结构的变化[6]。也有研究表明氮、磷等营养元素的积累也可能与物理吸附有关[7]。
由于自身“基质质量”的影响，针叶树种分解速率较慢。因此，采取有效措施提高凋落叶分解速率对于养分循环具有重要意义。研究表明，一种凋落叶的分解会受另外一种凋落叶的影响，存在混合效应[8]。与针叶凋落物相比，针阔混交能够加快分解速率；
也有研究得出针阔混交未起到促进作用[9-10]。目前，混合凋落叶对于分解的影响尚无定论[11]。
华北落叶松(Larixprincips-rupprechtii)是华北地区主要的速生用材林，在水土保持、涵养水源和防风固沙等方面发挥着极其重要的作用。塞罕坝机械林场营造了大面积的华北落叶松人工林[12]。白桦和蒙古栎是华北落叶松人工林的常见混交树种。本研究以塞罕坝地区华北落叶松、白桦(Betulaplatyphylla)和蒙古栎(Quercusmongolica)凋落叶为研究对象，采用凋落物分解袋法，研究分解过程中凋落叶养分和细菌群落动态变化及其相关性，为华北落叶松人工林树种混交和科学管理提供理论依据。
1.1 研究区概况
研究区位于河北省北部，冀蒙交界地(E 116°51′～117°39′，N 42 °02 ′～42 °36 ′ )，属于阴山余脉、大兴安岭余脉和内蒙草高原交错地区,是冀北地区森林-草原和干旱-半干旱交错带。海拔1 010～1 939.9 m，地势较平坦，地形以曼甸和丘陵为主。该地区是典型的半干旱半湿润寒温带大陆季风气候，年均温-1.3 ℃，年均最高气温33.4 ℃，年均最低气温-43.3 ℃。年均降水量460 mm,年均大风日数53 d，年均无霜期64 d。土壤类型以森林土和棕壤土为主。针叶树种以华北落叶松、樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)、云杉(Piceaasperata)为主，阔叶树种以白桦和蒙古栎为主。
1.2 试验设计
华北落叶松人工林基本情况，见表1。
表1 华北落叶松人工林基本情况Table 1 Condition of sample plots
由表1可知，本试验选择的3块落叶松人工林标准地基本信息，标准地大小为30 m×20 m。2017年10月收集华北落叶松、白桦和蒙古栎凋落叶，带回试验基地风干，去除杂质后备用。凋落叶设置4个处理：纯华北落叶松；
华北落叶松×白桦(1∶1)；
华北落叶松×蒙古栎凋落叶(1∶1)；
华北落叶松×白桦×蒙古栎凋落叶(1∶1∶1)。按4个处理分别称取24 g凋落叶装入分解袋(网眼孔径1 mm，规格30 cm×20 cm)。在每个样地中心位置设4个埋放点(分别对应4个处理)，各埋放点间隔1 m，每个处理埋放6袋，共计72袋。埋放时去除林地上层凋落物，埋放深度与凋落物层齐平，使之与腐殖质层充分接触，之后将少量凋落物覆盖在摆放好的凋落叶袋上，避免雨水冲刷以及意外丢失。
2017年10月埋袋前每种处理各留3袋用作初始养分分析。2018、2019年的5、7、9月份取回凋落叶袋，每次取样分别在3块样地中收集4种处理的样品，不同处理的测量结果取3块相同林龄样地的平均值。取样时要注意去除分解袋上附着的杂物，将分解袋带回实验室，分为2部分，一部分置于80 ℃烘箱内烘干48 h至恒重并记录，用于养分含量测定；
另外一部分置于-80 ℃超低温冰箱内，用于微生物群落结构测定。
1.3 凋落叶化学性质测定
根据《土壤农化分析》，凋落叶全碳含量采用氧化法测定；
全氮含量采用半微量凯式定氮法测定；
全磷含量采用钼蓝比色法测定；
全钾含量采用火焰光度计测定；
pH采用pH计测定。
1.4 细菌群落结构测定
采用CTAB方法对样品的DNA进行提取，之后使用无菌水将样本稀释至1 g/μl。使用带Barcode的特异引物和高效高保真酶进行PCR。采用OTU聚类分析和物种分类学分析来确定样本细菌在门水平上的群落组成。
1.5 数据分析
凋落叶养分释放率计算式：
Rt=(M0C0-MtCt)/M0C0×100%
(1)
式中：M0表示凋落叶初始干重(g)；
Mt表示凋落叶分解t时间后剩余干重(g)；
C0表示凋落叶初始养分含量；
Ct表示凋落叶分解t时间后的养分含量。
Shannon指数计算公式：
(2)
式中，Sobs是观测的OTU数，Fi是序列数为i的OTU数目，N是序列数目的和。
Simpson指数计算公式：
(3)
其中，Sobs是观测的OTU数，Fi是序列数为i的OTU数目，N是序列数目的和。
Chao1指数计算公式:
(4)
式中，Sobs表示样本中观察到物种数目，即实际OTU数；
F1表示仅有1条read的OTU数；
F2表示仅有2条read的OTU数。
ACE指数计算公式：
(5)
式中，Srare是小于等于“abound”条序列的OTU数目，Sabound为大于“abound”条序列的OTU数目，CACE是样本丰富度预测值，F1是序列数为1的OTU数目，γACE是稀有OTU的预测变异系数。
采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。凋落叶养分含量显著性检验采用单因素方差分析(ANOVA) 和最小显著差异法(LSD)，显著性水平设定为 α = 0.05。
利用 Uparse 软件对所有细菌样品进行聚类。采用Mothur方法进行物种注释分析，获得分类学信息并在门分类水平上统计各样本的细菌群落组成。使用Qiime软件计算Shannon，Simpson，Chao1和ACE等多样性指数，并用Origin软件作图。采取R软件的 Vegan 软件包中的冗余分析(Redundancy analysis, RDA)解释凋落叶养分与细菌群落之间的关系。
2.1 凋落叶养分含量变化
不同混合凋落叶养分含量，见图1。
图1 不同混合凋落叶土壤养分变化Figure 1 Changes of soil nutrients in different mixed litters注：L是华北落叶松；
LB是华北落叶松+白桦；
LQ是华北落叶松+蒙古栎 ；
LBQ是华北落叶松+白桦+蒙古栎；
下同。不同小写字母代表相同时间不同处理之间存在显著性差距(P<0.05)。
由图1可知，不同处理凋落叶的C含量整体上呈缓慢下降趋势；
分解300 d时，LQ的C含量显著低于LBQ；
分解360 d、600 d、660 d和720 d时，L的C含量高于LB、LQ和LBQ。不同处理的N含量随分解时间均呈上升趋势；
L的初始N含量显著高于其他处理；
分解600 d、660 d和720 d时，L的N含量低于其他混合凋落物叶。不同处理的P含量随时间变化呈波动上升趋势，各处理间无显著差异。各处理的K含量整体呈波动下降趋势；
L和LB的初始K含量显著高于LQ和LBQ；
分解240 d，LB的K含量显著高于其他处理。其他时期各处理间K含量无显著差异。从整体上看，各处理的凋落叶pH呈先降低后上升的趋势；
不同处理的初始pH有显著差异,L的初始pH显著低于其他混合凋落叶。分解240 d，各处理差异不显著；
分解300 d、360 d、600 d、660 d和720 d，L的pH显著低于其他混合凋落叶。
2.2 养分释放率
不同混合凋落叶养分释放率，见图2。
图2 不同混合凋落叶养分释放率随分解时间的变化Figure 2 Change of nutrient release rate of different mixed litters during decomposition time
由图2可知，凋落叶分解过程中，凋落叶C、N、K释放率为正值，表现为直接释放状态；
P释放率随分解时间表现为正-负-正，表现为淋溶-富集-释放状态。分解720 d时，凋落叶C释放率大小顺序为LBQ>LB>LQ>L；
N释放率为L>LQ>LB>LBQ；
P释放率为L>LBQ>LQ>LB；
K释放率为LBQ>LB>LQ>L。
2.3 细菌群落结构变化
不同混合凋落叶细菌优势群落组成随时间的变化,见表2。
表2 不同混合凋落叶细菌优势群落组成随时间的变化Table 2 Changes of bacterial dominant community composition in different mixed litters with decomposition time
由表2可知，在凋落物分解过程中，变形菌门(39.83%～77.16%)、蓝细菌门(0.17%～25.92%)、拟杆菌门(3.95%～23.88%)和放线菌门(1.64%～15.20%)是优势细菌门。微生物群落结构的变化主要是由优势菌的变化引起[13]。因此本研究只对凋落叶优势细菌进行分析，对于4种凋落叶来说，不同分解时间的优势细菌门存在显著差异。在L处理中，随分解时间增加，变形菌门相对丰度呈下降趋势，240 d、300 d、360 d的变形菌门相对丰度显著高于720 d；
蓝细菌门相对丰度随分解时间增加呈下降趋势，240 d的蓝细菌门相对丰度显著高于其他分解时间；
拟杆菌门相对丰度呈波动上升趋势，600 d和720 d拟杆菌门相对丰度显著高于240 d；
放线菌门相对丰度呈上升趋势,600 d、660 d和720 d的放线菌门相对丰度显著高于240 d、300 d和360 d。在LB处理中，变形菌门相对丰度随林龄的增加波动性降低，240 d的变形菌门相对丰度显著高于720 d；
240 d的蓝细菌相对丰度显著高于720 d；
拟杆菌门相对丰度先升高后降低，分解300 d达到最大值；
放线菌门相对丰度波动性上升，720 d达到最大值。在LQ处理中，变形菌门相对丰度呈下降趋势；
蓝细菌门相对丰度波动下降，分解240 d相对丰度最高；
拟杆菌门相对丰度随分解时间的增加先升高后降低，分解300 d达到最大值；
放线菌门相对丰度波动性上升，720 d达到最大值。在LBQ处理中，变形菌门和蓝细菌门相对丰度呈下降趋势，240 d二者的相对丰度显著高于其他分解时间；
随时间增加拟杆菌门相对丰度呈先升后降的趋势，600 d达到最大值。放线菌门相对丰度随时间的增加而上升，720 d达到最大值。
对于不同处理的混合凋落叶来说，240 d和600 d不同处理的4种优势菌没有显著差异；
300 d和360 d不同处理的变形菌门、蓝细菌门和放线菌门相对丰度没有显著差异，LB的拟杆菌门相对丰度显著高于L；
660 d的LQ的拟杆菌门相对丰度显著高于L、LB和LBQ；
720 d不同处理的蓝细菌门和放线菌门相对丰度没有显著差异，LQ的变形菌门相对丰度显著高于L、LB和LBQ ,L的拟杆菌相对丰度显著高于LB和LBQ。
2.4 细菌多样性差异
不同混合凋落叶细菌多样性指数，见表3。
表3 不同混合凋落叶细菌多样性指数Table 3 Diversity index of bacteria in different mixed leaf litter
表3(续)
由表3可知，对于4种处理的凋落叶来说，不同分解时间的细菌多样性指数和丰富度指数存在显著差异。其中Shannon和Simpson指数均随分解时间的增加呈上升趋势，在720 d达到最大值。Chao1和ACE指数随分解时间的增加呈波动性增加，L在360 d达到最大值；
LB和LQ在720 d达到最大值；
LBQ在360 d和720 d达到最大值。分解600 d、660 d、720 d时，混合凋落物(LB、LQ和LBQ)的Chao1和ACE指数均大于L，在720 d时，存在显著差异。
2.5 细菌群落与养分的关系
凋落叶细菌群落与养分的相关系数，见表4。
表4 凋落叶细菌与养分的相关系数Table 4 Correlation coefficient between litter bacteria and nutrients
由表4可知，凋落叶C含量与放线菌门呈极显著负相关；
凋落叶N含量与变形菌门和蓝细菌门呈极显著负相关，与放线菌门呈极显著正相关；
凋落叶P含量与拟杆菌门呈显著正相关；
K含量与放线菌门呈显著负相关；
凋落叶pH与变形菌门和蓝细菌门呈极显著负相关，与拟杆菌门和放线菌门呈极显著正相关。N和pH均与Shannon、Simpson、Chao1和ACE多样性指数呈极显著正相关；
P、Chao1和ACE呈极显著正相关；
K与Shannon指数呈显著负相关。
3.1 混合凋落叶对养分含量和养分释放的影响
凋落叶分解过程中养分元素会发生变化，其元素迁移模式公认有3种：(1)淋溶-富集-释放；
(2)富集-释放；
(3)直接释放[14]。各处理凋落叶中C、N、K呈直接释放状态，P呈淋溶-富集-释放状态，这与已有研究结果相似[15]。根据本课题组对20年华北落叶松人工林凋落叶的养分释放率发现，与本试验结果相比，华北落叶松及其混合凋落叶的C和N释放率均相对较高，可能是由于林龄不同导致[16]。凋落叶分解是以C元素为主导的物质循环过程。C组成了植物体内大部分的干物质，以碳水化合物形式存在，在淋溶作用下，C呈净释放[17]。经过720 d的分解，C含量整体上呈下降趋势。分解360 d后，与混合凋落叶相比，L的C含量维持在相对较高的水平且C的释放率较低，说明受混合凋落叶的影响，C含量释放加快，混和凋落叶对C的释放有促进作用，与已有研究结果相似[18]。N是组成蛋白质和氨基酸的基本元素，微生物可以通过氨化和硝化作用将凋落叶中的N转化为植物可以吸收的离子状态。N含量虽表现为上升趋势，但为直接释放模式，这与许多研究结果产生差异；
可能存在以下原因，凋落叶分解过程中N元素固定与释放的模式与凋落叶初始N含量有关，养分释放是养分含量和凋落叶干质量共同作用的结果[19-20]。本研究中初始N含量较高，导致N为直接释放模式；
P是组成植物遗传物质的重要元素，P的累积和释放与P含量密切相关。分解初期，P呈现淋溶状态，P元素含量下降。分解过程中，P作为限制微生物生长的养分元素而被固定，因此P表现为富集状态。当P含量升高到不在限制微生物生长时会被微生物矿化，导致P元素被释放；
K在植物体内多以离子形式存在，易受到淋溶作用呈释放状态，各处理的K含量整体上呈下降趋势；
LB、LQ和LBQ的pH呈缓慢增加的趋势，L则相反。凋落叶在微生物的分解作用下，产生富里酸水溶液，凋落叶呈酸性[21]。凋落叶含盐基、灰分较多，对酸性物质起到一定的中和作用，导致土壤pH先降低再缓慢增加。L的pH显著低于LB、LQ和LBQ，说明凋落叶混合能够改善凋落叶分解过程中的酸化程度。
3.2 细菌群落结构变化特征
相关研究表明，在分解过程中，凋落叶营养元素和微环境的变化会引起微生物群落结构的改变[22]。分解初期，土壤优势细菌门为放线菌门、蓝细菌门、拟杆菌门和放线菌门。分解中后期,土壤优势细菌门为放线菌门、拟杆菌门和放线菌门，蓝细菌门相对丰度显著降低，说明分解过程中细菌群落发生了演替[23]。分解前期，不同处理的优势细菌门无显著差异；
从分解300 d开始，不同混合凋落物的变形菌门和拟杆菌门相对丰度差异显著。随着分解时间增加，不同混合凋落叶的变形菌门和蓝细菌门相对丰度均减少；
凋落叶的放线菌门相对丰度均呈上升趋势。L的拟杆菌门相对丰度呈波动性上升趋势，LB、LQ和LBQ的拟杆菌门相对丰度呈先升高后降低，产生该差异的原因可能是由于细菌作为异养生物，拟杆菌门能够直接参与木质纤维素的降解[24]。不同细菌群落对养分和环境的需求不同，从而产生了不同的生长策略，导致细菌群落随分解时间的变化响应不同[25]。分解过程中，不同混合凋落叶的细菌多样性指数和丰富度指数均呈现上升趋势。这是因为随着凋落物分解，C、N、K等营养物质大量释放，供给微生物生长，导致细菌群落多样性和丰富度增加[26]。有研究表明，细菌在凋落叶分解后期起主要作用[27]。分解过程中，LB、LQ和LBQ的细菌群落丰富度指数高于L,可能是因为混合凋落物为细菌群落提供的分解底物种类也越多，有利于多种不同类型的细菌群落的生长，最终使得LB、LQ和LBQ的细菌丰富度高于L[28]。
3.3 凋落叶微生物与养分的关系
养分是微生物生长的物质条件，养分的变化影响微生物的群落结构。有研究表明，pH和全氮对微生物群落结构有重要影响，与本研究结果一致[29]。pH与优势细菌门(变形菌门、蓝细菌门、拟杆菌门和放线菌门)、细菌多样性指数均存在显著相关，对细菌群落影响较大；
凋落叶为细菌生长提供氮源，N通常在凋落叶分解过程中成为限制因素，影响微生物的群落变化[30]。在本研究中N与优势细菌门(变形菌门、蓝细菌门和放线菌门)、细菌多样性指数均存在显著相关。pH和N可能是限制细菌群落结构和凋落叶分解的主要因素。
在凋落叶720 d的分解过程中，不同混合凋落叶养分变化趋势一致，N和P含量整体上呈上升趋势，C和K含量变化趋势则相反，pH呈先下降后上升趋势。混合凋落叶(LB、LQ和LBQ)的C和K释放率均高于华北落叶松凋落叶，N和P释放率则相反。华北落叶松凋落叶pH显著低于混合凋落叶(LB、LQ和LBQ)。C、N、K为直接释放状态，P为淋溶-富集-释放状态。华北落叶松、白桦和蒙古栎凋落叶混合分解可以促进华北落叶松凋落叶中C的释放，但对N的释放有一定的抑制作用。凋落叶分解初期，不同处理凋落叶的优势细菌门为变形菌门、蓝细菌门、拟杆菌门和放线菌门；
分解300 d后，优势细菌门为变形菌门、拟杆菌门和放线菌门。在凋落物分解过程中，变形菌门和蓝细菌门相对丰度降低，拟杆菌门和放线菌门相对丰度升高。对于4种处理的凋落叶来说，不同分解时间的细菌多样性指数和丰富度指数存在显著差异。细菌多样性指数和丰富度呈上升趋势。凋落叶C含量与放线菌门呈极显著负相关(P<0.01)；
pH和N含量与细菌多样性指数呈极显著正相关(P<0.01)，P与Chao1和ACE存在极显著正相关(P<0.01)；
K与Shannon指数存在显著负相关(P<0.05)。华北落叶松、白桦和蒙古栎凋落叶混合可以提高部分C释放率，改善凋落叶酸碱度，提高分解过程中细菌多样性。
