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陈鸿波 孙聪慧 陈丹丹
细菌内毒素检查是安全性检测的关键指标之一，在药品、生物制品和医疗器械检验中是一项重要的质控技术，目前已被许多国家的药典标准收录[1]。细菌内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的脂多糖成分，是最普遍和最主要的外源性致热原[2]，极微量(1～5 ng/kg)进入人体即可引起发热反应[3]，大剂量可能会导致内毒素中毒休克、弥散性血管内凝血，甚至死亡[4]。细菌内毒素含量过高不仅会导致人体发烧，还会产生细胞毒性。目前最常规的细菌内毒素检测方法是凝胶法，此外还有动态显色法和动态浊度法两种定量方法也收录在药典中。其中，动态显色法是根据游离的对硝基苯胺与细菌内毒素浓度成正比的相对关系而进行定量测定的一种分析方法[5]。
动态浊度法是根据反应液浑浊度上升的速度和反应液中内毒素浓度成比例的原理所设计的定量测定方法[6]。
精子梯度分离液作为辅助生殖类医疗器械，其安全性检测是临床使用安全的必要保证。该样品为含有硅烷涂层二氧化硅颗粒的悬浮性缓冲溶液，其主要成分中的硅烷涂层SiO2(含有二氧化硅纳米粒子，19 nm±4 nm，用于梯度分离)、稳定pH的羟乙基哌嗪乙硫磺酸、螯合剂二水合乙二胺四乙酸二钠、NaCl、KCl和CaCl2，其作用是调节渗透压。其他的成分葡萄糖、乳酸钙和丙酮酸钠用于提供能量，还有纯化水等。由于该样品成分复杂，常规的凝胶法有干扰无法进行检测，所以必须为这类复杂成分样品的细菌内毒素实验建立方法，满足临床使用的安全性。以往的相关研究中这些内毒素检测方法在使用时，通常一个样品只会用一种细菌内毒素方法进行检测。本研究在国内外首次提出动态浊度法和动态显色法两种定量实验方法互相印证，保证了实验结果的准确。
1.1 测试样品
精子梯度分离液，规格：100 mL/瓶，批号：00PS4019002，型号：PS40-100。
1.2 细菌内毒素检测实验[7-12]
1.2.1 标准曲线可靠性验证实验
按照《中国药典》细菌内毒素检查法规定，进行鲎试剂的标准曲线可靠性实验，动态显色法和浊度法鲎试剂经用细菌内毒素国家标准品检查，结果符合规定。
所得标准曲线相关系数r的绝对值均大于0.980，符合标准曲线可靠性验证的要求。
1.2.2 精子梯度分离液最大有效稀释倍数(maximum valid dilute double,MVD)的计算公式
MVD=L×C/λ
式中：L为精子梯度分离液的细菌内毒素限值0.5 EU/mL。C为供试品的浓度，当L以EU/mL表示时，则C等于1.0 mL/mL。λ为所用标准曲线的最低检测限0.01 EU/mL。
则精子梯度分离液的对应最大有效稀释倍数为：
MVD=0.5 EU/mL×1.0 mL/mL÷0.01 EU/mL=50倍。
要在供试品的稀释倍数不大于50倍的情况下进行细菌内毒素检测。
选择10倍为实验稀释倍数。
1.2.3 实验操作
(1) 标准曲线。取细菌内毒素国家标准品，用细菌内毒素检查用水稀释至10 EU/mL、1 EU/mL、0.1 EU/mL、0.01 EU/mL，共4个浓度，每个浓度做2个平行孔检测。
(2) 供试品溶液。取精子梯度分离液，用细菌内毒素检查用水稀释10倍。供试品稀释液做2个平行孔检测。
(3) 供试品回收溶液。取供试品稀释液0.1 mL，加入10 uL浓度为1 EU/mL细菌内毒素标准溶液，使最终标准内毒素含量为0.1 EU/mL，再加入0.1 mL鲎试剂，做回收率检测，供试品回收溶液做2个平行孔检测。
(4) 阴性对照。以细菌内毒素检查用水为阴性对照，做2个平行孔。
2.1 动态显色法内毒素检测实验
标准曲线lgT=6.01+(-0.248lgC)，r=-1，鲎试剂批号：1904260，样品稀释倍数10倍，回收率105.6%，供试品溶液内毒素浓度为0.195 EU/mL。
2.2 动态浊度法内毒素检测实验
标准曲线lgT=6.04+(-0.233lgC)，r=-0.999，鲎试剂批号：1903290，样品稀释倍数10倍，回收率164.8%，供试品溶液内毒素浓度为0.269 EU/mL。
为临床使用安全，精子梯度分离液必须进行细菌内毒素检测。但是精子梯度分离液由于组成成分复杂，含有纳米粒子、稳定pH值成分、螯合剂成分、调节渗透压成分、葡萄糖等成分，这些复杂的成分都有可能对细菌内毒素实验产生干扰，导致假阴性或假阳性结果。例如，其中的螯合剂成分，会把内毒素和鲎试剂反应所必需的游离二价钙镁离子螯合，导致凝集反应不能进行，但因本产品含有大量的氯化钠和氯化钾，替代了钙镁离子，因而未表现出抑制干扰作用，出现了假阳性结果。
在凝胶限量法实验中，将样品稀释到最大有效稀释倍数32倍[13-15]，样品表现出强烈干扰，导致凝胶法无法进行检测。于是将精子梯度分离液使用细菌内毒素检查用水稀释10倍，然后采用动态显色和动态浊度法检测，供试品的回收率均在50%～200%，符合细菌内毒素光度测定法的要求。说明精子梯度分离液可适用细菌内毒素动态显色法和动态浊度法检查，得出样品细菌内毒素含量分别为0.195 EU/mL和0.269 EU/mL，这两种定量方法得出的检测数值都是无干扰的有效数值，所以可以确认该产品(批号：00PS4019002)的细菌内毒素含量是小于0.5 EU/mL的，低于规定的限值，符合规定。
为了辅助生殖类医疗器械临床使用时减少不良反应发生率，当含有纳米成分的样品用凝胶法无法检测时，建议要有两种定量方法检测都合格，才能判定产品符合规定。本研究建立了精子梯度分离液的细菌内毒素实验检测的方法，解决了含复杂成分的医疗器械在用凝胶法无法检测时如何进行细菌内毒素实验的难题。本方法可以作为一种通用方法，对于复杂样品具有很好的适用性，通过两种不同反应原理(一个是通过颜色变化进行定量，一个是通过浊度变化进行定量)的细菌内毒素定量方法相互印证，可以保证结果正确，避免了假阳性和假阴性的可能性。
在二十余年的检测工作中，笔者一共遇到两个生产厂家生产的精子梯度分离液，其中一个生产厂家的精子梯度分离液在细菌内毒素实验中可以使用凝胶法检测，另一个生产厂家的产品就是本文中提到的精子梯度分离液，用凝胶法有干扰，无法检测。笔者猜测这两个厂家的产品具体成分有不同因而导致凝胶法实验中表现为有干扰和无干扰的两种情况。本研究提出用两种内毒素定量方法互相印证的研究思路对精子梯度分离液进行了检测，希望对业内同行是一个有益的启发。
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