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李振江，孙德超，孔晨旭，耿亚东，徐晨阳，丁炳谦
胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，恶性度、发病率和复发率较高，预后较差［1］。替莫唑胺（TMZ）是治疗胶质瘤的重要化学药物，但多数患者容易出现TMZ耐药现象［2］，故提高其疗效十分重要。Wnt可通过经典及非经典途径调控β-连环素（β-catenin）活性，调节细胞内目的基因表达，参与细胞增殖、迁移、凋亡等生理活动及肿瘤多药耐药性［3］。研究发现，抑制Wnt/β-catenin通路活性可阻断依赖O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT）的DNA修复途径活化，降低胶质瘤细胞对TMZ的化疗耐药性，因此，Wnt/β-catenin通路有望成为提高胶质瘤TMZ化疗疗效的潜在干预靶点［4］。溴结构域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）是一种致癌因子，在多种肿瘤中高表达［5］。BRD4在胶质瘤组织中的表达水平与胶质瘤患者的总生存期呈负相关［6］。BRD4高表达可引起Wnt/β-catenin通路活化，抑制或降解BRD4可阻断Wnt/β-catenin通路活化，发挥抗癌作用［6］。由此推测，BRD4可能与Wnt/β-catenin通路存在间接或直接联系。白藜芦醇（resveratrol，RES）为天然多酚类化合物，能通过多种生化作用发挥较为活跃的抗肿瘤作用［7］。RES具有脂溶性，可透过血脑屏障，发挥抗颅内肿瘤生长作用［8］。另外，RES可增强TMZ对脑胶质瘤的治疗作用［9］，但其作用机制有待探究。本研究从BRD4及Wnt/β-catenin通路出发，探究RES提高胶质瘤细胞化疗敏感性的机制，为提高胶质瘤化疗效果提供参考。
1.1材料清洁级雄性NUDE大鼠20只，42～49日龄，体质量（230±5）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0011。本研究符合3R原则。人神经胶质瘤TMZ低敏细胞株（U138）、耐药株（T98G）购自ATCC；
高敏细胞株（U251）购自中国科学院细胞资源中心；
注射用TMZ购自江苏恒瑞医药公司；
RES、DMEM培养基购自Sigma公司；
BRD4抑制剂JQ1购自MCE公司；
Wnt3a/βcatenin通路激活剂LiCl购自Selleck公司；
BRD4过表达质粒pcDNA BRD4及阴性对照质粒pcDNA NC由上海吉玛基因公司合成；
兔抗人BRD4、Wnt3a、β-catenin、Ki67抗体，小鼠抗人TMZ耐药蛋白（MGMT）、内参β-actin抗体及羊抗兔或羊抗小鼠二抗购自Abcam公司；
CCK-8试剂、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自南京诺唯赞生物公司；
酶标仪（型号：MultiskanTMFC）购自Thermo公司；
流式细胞仪（型号：FACSCanto II）购自BD公司；
凝胶成像系统（型号：Tanon 1600/1600R）购自Tanon公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养及分组处理取适量U138、U251、T98G细胞37℃水浴复苏后，于DMEM培养基（含10%胎牛血清）和恒温培养箱中传代培养、计数。取对数生长期T98G细胞，按1×106个/孔接种于6孔板内，进行如下处理：（1）不同浓度（0、5、10、50、100、200 μmoL/L）RES和不同浓度（0、10、50、100、200、400 μmoL/L）TMZ单独培养，72 h后测定增殖活性，选择50 μmoL/L RES及100 μmoL/L TMZ进行后续实验。（2）设置对照1组（添加100 μmoL/L TMZ）、RES1组（添加50 μmoL/L RES）、RES+TMZ（同时添加100 μmoL/L TMZ和50 μmoL/L RES）组，培养72 h，另用CCK-8法绘制生长曲线并计算RES存在或不存在时细胞对TMZ的耐药指数，耐药指数=添加RES时半数抑制浓度（IC50）/未添加RES时IC50。（3）在添加100 μmoL/L TMZ的基础上，对T98G细胞转染pcDNA BRD4（或pcDNA NC）或加入50 μmoL/L RES2，分别作为pcDNA NC组、pcDNA BRD4组、RES2组、RES+pcDNA BRD4组。（4）参照文献［10］和［11］在添加100 μmoL/L TMZ的基础上加入250 nmoL/L JQ1或40 μmoL/L LiCl，依次作为对照2组、JQ1组、JQ1+LiCl组。
1.2.2CCK-8法检测细胞增殖取培养72 h的各组细胞，加入10 μL的CCK-8溶液干预培养4 h，读取酶标仪450 nm波长处光密度（OD）值。根据OD值绘制生长曲线。细胞增殖活性（%）=（OD药物-OD空白）/（OD对照-OD空白）×100%。
1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡各组细胞培养72 h，取细胞，PBS洗涤、4℃加入75%冷乙醇固定过夜，PBS洗涤重悬细胞后顺次加入Annexin V-FITC染色液、PI染液，混匀后4℃避光孵育30 min。流式细胞仪检测凋亡率。
1.2.4Western blot检测蛋白表达取对数生长期U138、U251、T98G细胞粉碎匀浆后，提取蛋白并测定浓度，取蛋白100 μg行上样、电泳及转膜操作，滴加1∶800的一抗（BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT）及1∶900的β-actin抗体孵育过夜，二抗孵育50 min，化学发光法显影曝光，凝胶成像系统拍照并计算条带相对灰度值，以目的蛋白与内参蛋白的比值计算蛋白相对表达水平。
1.2.5裸鼠成瘤验证RES的作用裸鼠麻醉后，向左侧肩胛区皮下注射200 μL（1×106个细胞）T98G单细胞悬液，无菌条件下饲养12 d，注射部位有明显瘤块突起为成瘤成功［9］。按随机数字表法将裸鼠分为对照治疗组、TMZ治疗组、RES+TMZ治疗组、RES+TMZ+JQ1治疗组，每组5只，对照治疗组腹腔注射DMSO溶液，TMZ治疗组腹腔注射50 mg/kg TMZ，RES+TMZ组在TMZ治疗的基础上，腹腔注射40 mg/kg RES治疗［9］，RES+TMZ+JQ1组在RES+TMZ治疗的基础上给予1 mg/kg JQ1［10］腹腔注射治疗。1次/d，连续给药30 d后处死大鼠。取瘤体，4%多聚甲醛固定，制成5 μm的石蜡切片，脱蜡、水化、H2O2处理后，加入1∶200的一抗Ki67抗体孵育过夜，二抗孵育1 h，DAB显色，置于光镜下观察拍照。Image J软件计算单位面积内Ki67阳性染色的OD值。另用Western blot法检测瘤体中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达。
1.3统计学方法采用SPSS 24.0软件分析数据，符合正态分布的数据用±s表示，2组间比较采用t检验；
多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 TMZ不同 敏 感 细胞株中BRD4、Wnt3a、βcatenin及MGMT蛋白表达变化比较与U251细胞相 比，U138、T98G的BRD4、Wnt3a、β-catenin及MGMT表达依次升高（P＜0.05），见图1、表1。
Fig.1 Immunoblot of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression in different sensitive cell lines of TMZ图1 TMZ不同敏感细胞株中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达免疫印迹图
Tab.1 Comparison of protein expressions of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT between different sensitive cell lines of TMZ表1 TMZ不同敏感细胞株中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达比较 （n=6，±s）
Tab.1 Comparison of protein expressions of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT between different sensitive cell lines of TMZ表1 TMZ不同敏感细胞株中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达比较 （n=6，±s）
＊＊P＜0.01；
aU251相比，b与U138相比，P＜0.05。
细胞系U251 U138 T98G F BRD4 0.38±0.06 0.91±0.11a 1.85±0.21ab 166.826＊＊Wnt3a 0.42±0.07 1.23±0.13a 2.09±0.28ab 125.287＊＊β-catenin 0.26±0.05 1.52±0.14a 2.17±0.26ab 189.237＊＊MGMT 0.63±0.07 1.78±0.12a 2.69±0.24ab 249.449＊＊
2.2 RES对T98G细胞增殖、凋亡、耐药性、BRD4及Wnt3a/β-catenin通路的影响0、5、10、50、100、200 μmoL/L RES单独处理T98G细胞72 h，当其浓度为5～50 μmoL/L时，细胞增殖活性下降，并在50～200 μmoL/L时保持稳定，见图2。选择50 μmoL/L RES进行后续实验。
Fig.2 Effects of different concentrations of RES on the proliferation activity of T98G cells图2不同浓度RES对T98G细胞增殖活性的影响
0、10 、50、100、200、400 μmoL/L TMZ单独处理T98G细胞72 h，当浓度为10～100 μmoL/L时，细胞增殖活性下降，并在100～400 μmoL/L时保持稳定，见图3。选择100 μmoL/L TMZ进行后续实验。
Fig.3 The effect of different concentrations of TMZ on the proliferation activity of T98G cells图3不同浓度TMZ对T98G细胞增殖活性的影响
与对照1组相比，RES1组、RES+TMZ组T98G细胞凋亡率依次升高，BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达及细胞增殖活性依次降低（P＜0.05），见图4、5，表2。
Fig.4 Flow cytometry chart of apoptosis of T98G cells in each group图4各组T98G细胞流式凋亡图
Fig.5 Immunoblot results of BRD4,Wnt3a,β-catenin,MGMT protein expression图5 BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达免疫印迹图
Tab.2 Effects of RES on the proliferation activity,apoptosis rate and protein expression of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT in T98G cells表2 RES对T98G细胞增殖活性、凋亡率及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达的影响（n=6，±s）
Tab.2 Effects of RES on the proliferation activity,apoptosis rate and protein expression of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT in T98G cells表2 RES对T98G细胞增殖活性、凋亡率及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达的影响（n=6，±s）
＊＊P＜0.01；
a与对照1组相比，b与RES1组相比，P＜0.05。
组别对照1组RES1组RES+TMZ组F增殖活性（%）100.00±5.06 51.19±6.71a 25.47±2.63ab 332.660＊＊凋亡率（%）9.14±2.13 23.19±4.08a 45.36±6.52ab 94.239＊＊BRD4 1.78±0.19 1.36±0.27a 0.74±0.12b 39.929＊＊组别对照1组RES1组RES+TMZ组F Wnt3a 1.32±0.18 0.93±0.16a 0.42±0.11b 52.305＊＊β-catenin 1.86±0.33 1.47±0.12a 0.65±0.18b 44.096＊＊MGMT 2.19±0.48 1.68±0.23a 1.04±0.13b 19.909＊＊
生 长 曲 线 见 图6，RES干 预 时，T98G细 胞TMZIC50、耐药指数分别为（53.47±5.40）μmoL/L、0.53±0.05，显著低于无RES时的（100.08±9.14）μmoL/L、1.00±0.08（tTMZIC50=10.755，t耐药指数=12.203，均P＜0.05）。
2.3 过表达BRD4可减弱RES对T98G细胞TMZ耐药性的逆转作用与pcDNA NC组相比，pcDNA BRD4组T98G细胞BRD4蛋白表达升高（P＜0.05），见图7、表3。与pcDNA NC组相比，pcDNA BRD4组T98G细胞Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达及增殖活性升高，凋亡率降低（P＜0.05）；
与RES2组相比，RES+pcDNA BRD4组Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达及增殖活性升高，凋亡率降低（P＜0.05），见图7、8，表3。
Fig.6 The effect of RES on TMZIC50 in T98G cells图6 RES对T98G细胞TMZIC50的影响
Fig.7 Western blot assay of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression图7 BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达免疫印迹图
2.4 BRD4对Wnt3a/β-catenin通路的影响相比对照2组，JQ1组增殖活性及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达水平降低（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05）。与JQ1组相比，JQ1+LiCl组增殖活性、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达升高，凋亡率降低（P＜0.05），见图9、10，表4。
2.5 RES的体内实验验证结果与对照治疗组相比，TMZ治疗组瘤 体 中Ki67、BRD4、Wnt3a、βcatenin、MGMT蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与TMZ治疗组相比，RES+TMZ治疗组、RES+TMZ+JQ1治疗 组瘤 体 中Ki67、BRD4、Wnt3a、βcatenin、MGMT蛋白表达降低（P＜0.05），且RES+TMZ+JQ1组瘤体中Ki67及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达最低（P＜0.05），见图11、12，表5。
Fig.8 Flow cytometry chart of apoptosis of T98G cells图8 T98G细胞流式凋亡图
Tab.3 Comparison of cell proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the four groups表3各组细胞增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达比较 （n=6，±s）
Tab.3 Comparison of cell proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the four groups表3各组细胞增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达比较 （n=6，±s）
＊＊P＜0.01；
a与pcDNA NC组相比，b与pcDNA BRD4组相比，c与RES2组相比，P＜0.05。
组别pcDNA NC组pcDNA BRD4组RES2组RES+pcDNA BRD4组F增殖活性（%）100.02±6.18 160.73±15.02a 51.23±6.84a 93.42±7.15bc 134.977＊＊凋亡率（%）9.16±1.09 2.74±0.16a 22.36±5.07a 13.75±1.26bc 57.308＊＊BRD4 1.78±0.19 2.53±0.26a 1.32±0.28a 1.96±0.41 17.162＊＊Wnt3a 1.32±0.18 2.45±0.31a 0.92±0.25a 1.76±0.19bc 45.382＊＊β-catenin 1.86±0.33 2.84±0.37a 1.42±0.18a 2.15±0.37bc 20.542＊＊MGMT 2.07±0.38 2.95±0.41a 1.57±0.15a 2.51±0.17bc 23.081＊＊
Fig.9 Flow cytometry chart of apoptosis of T98G cells图9 T98G细胞流式凋亡图
Tab.4 Comparison of proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the three groups表4各组增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达的比较 （n=6，±s）
Tab.4 Comparison of proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the three groups表4各组增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达的比较 （n=6，±s）
＊＊P＜0.01；
a与对照2组相比，b与JQ1组相比，P＜0.05。
组别对照2组JQ1组JQ1+LiCl组F增殖活性（%）100.00±6.43 51.19±7.42a 98.23±7.51b 92.280＊＊凋亡率（%）11.43±3.15 29.15±3.87a 13.46±3.21b 48.089＊＊BRD4 1.69±0.13 1.28±0.17a 1.25±0.19 13.282＊＊Wnt3a 1.31±0.19 0.89±0.07a 1.25±0.09b 18.916＊＊β-catenin 1.84±0.32 1.36±0.17a 1.79±0.12b 8.603＊＊MGMT 2.15±0.23 1.82±0.09a 2.09±0.11b 7.609＊＊
胶质瘤占脑部肿瘤的半数以上，是神经外科最难治疗的肿瘤［12］。TMZ是临床治疗胶质瘤的有效药物，但有48%～58%的患者对TMZ化疗不敏感［13］，故探寻胶质瘤化疗耐药的分子机制对提高TMZ化疗效果有重要意义。
TMZ可通过甲基化DNA分子并使DNA在复制过程中出现碱基错配，引起DNA链断裂、损伤，发挥细胞毒性作用［14］。但MGMT表达升高后可转移鸟嘌呤上的烷化基团，阻断DNA损伤，介导耐药性产生［15］。如何干预MGMT表达已成为提高胶质瘤TMZ化疗敏感性的重要研究方向。有研究发现，Wnt/β-catenin通路活化是引起MGMT抗药修复系统激活的关键原因［16］。Wnt通路被激活时，Wnt与相关受体结合后会促进细胞质中β-catenin进入细胞核，调节增殖、生长及耐药蛋白如P-糖蛋白等基因转录，介导多重耐药［17］。此外，Wnt/β-catenin通路已被认为参与MGMT的转录调控过程［18］。本研究发现，高敏株、低敏株、耐药株中的MGMT及Wnt/βcatenin通路蛋白表达依次升高，提示Wnt3a/βcatenin通路活化与胶质瘤TMZ耐药密切相关。但引起Wnt3a/β-catenin通路活化的上游调控机制还不明确。
Fig.10 Immunoblot results of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression图10 BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达免疫印迹图
Fig.11 Immunohistochemical staining showing Ki67 in tumor图11瘤体内Ki67免疫组化染色图（标尺：50 μm）
Fig.12 Immunoblot results of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression in tumor图12瘤体中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达免疫印迹图
Tab.5 Comparison of Ki67,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expressions in tumors between the four groups表5瘤体中Ki67、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达比较 （n=5，±s）
Tab.5 Comparison of Ki67,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expressions in tumors between the four groups表5瘤体中Ki67、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达比较 （n=5，±s）
＊＊P＜0.01；
a与TMZ治疗组相比，b与RES+TMZ组相比，P＜0.05。
组别对照治疗组TMZ治疗组RES+TMZ治疗组RES+TMZ+JQ1治疗组F Ki67（光密度/mm2）2.13±0.18 2.10±0.21 1.47±0.13a 0.85±0.09ab 72.557＊＊BRD4 1.57±0.10 1.53±0.12 1.18±0.15a 0.61±0.11ab 66.924＊＊Wnt3a 1.83±0.14 1.82±0.18 1.27±0.12a 0.53±0.06ab 107.569＊＊β-catenin 1.25±0.16 1.23±0.15 0.96±0.12a 0.48±0.07ab 38.160＊＊MGMT 2.13±0.17 2.10±0.14 1.71±0.19a 1.06±0.12ab 50.141＊＊
BRD4可间接或直接引起Wnt3a/β-catenin通路活化而发挥致癌及促癌作用。BRD4能驱动原癌基因（C-MYC）、凋亡调节因子（BCL-2）、程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）等关键致癌基因转录，加速肿瘤发展，还可激活DNA损伤检查点来修复损伤DNA，提高癌细胞防御外界损伤的能力［19］。另外，BRD4能够通过调节miR-142-5p、miR-216-3p等的表达，进而影响其靶基因Wnt3a表达，促进Wnt/β-catenin通路活化，参与癌症的发展［6，20］。本研究发现，高敏株、低敏株、耐药株中的BRD4表达也逐渐升高。使用BRD4抑制剂JQ1可显著抑制BRD4表达，同时抑制T98G细胞增殖及Wnt3a/β-catenin、MGMT蛋白表达，促进其凋亡，提高其对TMZ化疗的敏感性；
反之，Wnt/β-catenin通路激活剂可减弱JQ1的上述作用，提示BRD4可调控Wnt3a/β-catenin通路活化，参与胶质瘤TMZ耐药。
RES具有抗氧化、抗炎、促进自噬、调控线粒体呼吸功能等作用［21］。研究发现，RES还能与顺铂、TMZ等化疗药物协同作用，降低化疗药物诱导细胞死亡的阈值，提高化疗效果［7，9］。本研究也发现，RES在提高胶质瘤对TMZ化疗敏感性的同时，还可抑 制BRD4、Wnt3a/β-catenin及MGMT表 达，且BRD4高表达可明显减弱RES对T98G细胞TMZ耐药性的逆转作用，提示RES对T98G细胞TMZ耐药性的逆转作用可能与抑制BRD4、Wnt3a/β-catenin及MGMT表达有关。另外，体内实验也发现，与TMZ治疗相比，RES+TMZ治疗组、RES+TMZ+JQ1治疗组瘤体中Ki67、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达降低，提示RES可激活TMZ对瘤体内Wnt3a/βcatenin通路、MGMT表达和细胞增殖的抑制作用，JQ1可加强上述作用。
综上所述，RES可能通过下调BRD4，进而抑制Wnt3a/β-catenin通路活化，实现对胶质瘤T98G细胞TMZ耐药性的逆转。本研究为阐明胶质瘤TMZ化疗耐药性产生的分子机制提供了一定参考，也为治疗胶质瘤提供了新的化疗思路。但BRD4、Wnt3a/β-catenin及MGMT之间的靶向关系仍需继续探究。
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