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方星 张信辉 邢辉 杨晓慧 赵明伍 柳兴凤
(1.贵州省疾病预防控制中心/实验中心，贵州 贵阳 550004；
2.中国疾病预防控制中心/性病艾滋病预防控制中心，北京 102206；
3.黔南州疾病预防控制中心，贵州 都匀 558000；
4.遵义市疾病预防控制中心，贵州 遵义 563000；
5.遵义医科大学/贵州省普通高等学校脑科学特色重点实验室，贵州 遵义 563000)
全球扩大抗逆转录病毒治疗(antiretroviral therapy，ART)通过有效抑制 HIV 感染者体内病毒的复制导致HIV-1 发病率和病死率大幅下降，使艾滋病成为慢性可治疗的疾病[1-2]。随着我国艾滋病ART工作的快速推广和ART人数的增长，以及药物的有限选择下，HIV耐药株的问题已经日益凸显，特别是在贵州省长期实施ART后，ART前的原发耐药值得关注。而我省之前主要关注治疗后的获得性耐药，所以本研究对2018年1—12月贵州省南北部地区(黔南州、遵义市)ART前388名新发现的HIV感染者进行耐药检测，对其HIV-1耐药基因型和耐药株的流行水平进行分析，为控制HIV耐药株的流行提供参考依据。
1.1研究对象 2018年贵州省南北部地区(黔南州、遵义市)1—12月开始抗病毒治疗前、年龄≥18岁的新发现HIV感染者，在提供书面知情同意书后，按初始的ART时间先后顺序入组，收集流行病学资料，并采集ART前的抗凝静脉血并分离血浆，运送到贵州省艾滋病确证中心实验室。
1.2检测方法 采用in-house方法进行耐药检测。使用 MagNA Pure LC 全自动核酸提取仪和 MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit(德国，Roche)提取血浆RNA。用 One Step RNA PCR Kit(AMV)(日本，Takara)和引物 MAW26、RT21(北京，天一辉远)进行逆转录和巢式PCR 扩增pol基因区，引物序列见表1。琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段1.3kb后，送北京天一辉远生物科技有限公司进行PCR 产物纯化、测序、序列拼接和校对。
表1 耐药基因检测引物序列
1.3基因型、耐药程度分析 将得到包括蛋白酶区1～99氨基酸和逆转录酶区1～300氨基酸的pol基因区序列，提交美国斯坦福大学的网络HIV数据库进行基因型分析、耐药性突变位点分析和对各种抗病毒药物的耐受程度分析，对任何一种药物出现低度及以上耐药即判断为基因型耐药。
2.1调查对象的基本特征 共调查2018年1—12月贵州省南北部黔南州和遵义市抗病毒治疗前、年龄≥18岁的新发现HIV感染者388例，并采集抗凝血样。经提取、扩增和测序，获得341例pol区基因片段。其中，纳入对象性别比为234/107(男/女)，年龄18～83岁，平均(48.94±14.96)岁，汉族与少数民族比例为 237/104。调查时CD4+T淋巴细胞≤200个/μL占30.5%(104/341)，201～350个/μL占25.81%(88/341)，351～500个/μL占15.54%(53/341)，>500个/μL占6.61%(21/341)，缺失CD4+T淋巴细胞的占21.99%(75/341)。病毒载量检测比例为61.58%(210/341)，病毒载量≤1 000 copies/mL占1.17%(4/341)，1 001～100 000 copies/mL占31.09%(106/341)，>100 000 copies/mL占29.33%(100/341)。婚姻状况，未婚者占16.42%(56/341)，已婚或同居者占50.15%(171/341),离婚或丧偶者占31.67%(108/341)。传播途径以异性传播为主(94.43%，322/388)，同性传播占3.81%(13/341)。见表2。
表2 341例获得pol区基因片段HIV感染者的基本情况[n(%)]
2.2研究对象HIV-1基因亚型的分布情况 在得到的341份pol区基因片段中，发现8种HIV-1基因型,其中占比最多的基因型是CRF01_AE(54.55%,186/341)，其次为CRF07_BC(27.57%,94/341)和CRF08_BC (12.90%,44/341)，其他亚型还包括CRF55_01B以及A、B、C、D亚型。
2.3研究对象HIV-1耐药发生情况 发现耐药突变的比例为12.02%(41/341)，包括NRTIs耐药突变1.76%(6/341)，ABC、FTC、3TC耐药分别达0.88%(3/341)，HIV耐药突变位点；
NNRTIs相关耐药突变9.68%(33/341)，其中，EFV耐药占7.33%(25/341)、NVP耐药占9.09%(31/341)；
PIs耐药突变占1.17%(4/341)，HIV耐药突变位点。发生NRTIs和NNRTIs、NNRTIs和PIs交叉耐药分别占0.29%(1/341)。耐药基因突变主要与非核苷反转录酶抑制剂 (NNRTIs)(33/341，9.68%)有关。V179(18/341，5.28%)是其中较突出的突变位点，其次为V106(7/341，2.05%)、E138(6/341,1.76%)。见表3。
表3 41例HIV-1感染者耐药特征分析
HIV耐药株的出现使感染者ART的效果下降，同时耐药株在未治疗人群中的传播和流行也给ART的长期实施增加障碍。本研究对2018年1—12月贵州省南北部地区(黔南州、遵义市)ART前388名新发现的HIV感染者进行耐药检测，对得到的341份pol区基因片段的HIV-1耐药基因型和耐药突变的流行水平进行分析研究。
在亚型的分布上，贵州省HIV以CRF01_AE为主，占54.55%，其次为CRF07_BC和CRF08_BC，也有多种其他亚型(CRF55_01B以及A、B、C、D亚型并存)，这与柳兴凤等人的2013-2017年贵州省艾滋病患者HIV亚型分布研究[3]结果一致，也与我省以性传播流行毒株亚型相符合[3-4]。
贵州省2009年及2015年的HIV耐药警戒线调查显示耐药率分别为0、3.5%，均小于5%，为低流行水平[5-6]。而此次调查发现HIV耐药株的比例为12.02%，根据WHO耐药监测指南的标准，已达到中度耐药水平，耐药为单重耐药与多重耐药并存，并且已发现有PI类药物的原发耐药，类型复杂多样，因此应重点关注当地HIV耐药株的流行，这可能与扩大ART的覆盖面积产生的耐药株有关。耐药基因突变主要与非核苷反转录酶抑制剂(NNRTIs)有关，V179是NNRTIs出现最多的突变位点，其次为V106、E138，这与目前使用一线的ART方案实施情况相符。
综上所述，HIV耐药株在贵州省南北部地区新发现的艾滋病感染者中出现中度流行，类型复杂，因此应适时在省内全面开展治疗前的耐药监测，以减少原发耐药毒株的产生和传播。
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