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贾坤平，孙忠人，刘关平，裴思颖，蔡国锋，伊思锐,刘 源,梁 群
(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；
2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；
3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)
脓毒症是一种由宿主对感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍，可导致组织损伤和器官功能障碍[1]，甚至是死亡率极高的多器官功能障碍综合征(MODS)[2]，其发病率已达535人/10万人，住院死亡率高达25%～30%，是世界各地仍需攻克的一项艰巨任务[3]。脓毒症的病情发展较快、预后较差和病死率较高，是重症医学难题之一。根据《脓毒症全球负担报告》，每年有4 900万人受到感染，导致1 100万人死亡，最常见的感染部位为肺部、尿路、腹腔和循环系统的原发感染[4]。中国是脓毒症发生率与死亡率较高的地区，2018年流行病学数据显示，中国脓毒症患者每年3 238万人，死亡率为66.7%[5]，高出全球平均水平。2020年《Lancet》最新数据显示，全球因脓毒症死亡人数占全球死亡总数的19.7%。脓毒症成为威胁人类生命健康的重要病症之一[6]。尽管脓毒症的研究已日趋深化，临床上不断有更新换代的抗生素投入使用，但至今脓毒症的死亡率仍未见显著下降。因此，中医药多靶点的治疗优势在脓毒症的治疗中日渐凸显。本研究通过梳理和分析关于miRNA-脓毒症、脓毒症-针灸等相关理论和临床研究，从微小RNA(MicroRNA,miRNA)视角出发为针灸治疗脓毒症提供新的治疗靶点，为中医针灸在急危重症的临床推广和应用提供理论依据。
脓毒症不仅是一个全身炎症反应或免疫紊乱的过程，更涉及到体内多个器官功能的改变。如图1[7]所示，在细胞和分子水平，脓毒症的发病机制非常复杂，包括炎症反应失衡、免疫功能紊乱、线粒体损伤、凝血机制受损、神经内分泌免疫网络异常、内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)、自噬和其他病理生理过程，并最终导致器官功能障碍[7]，而miRNA在脓毒症细胞信号转导和调节免疫应答中发挥重要作用[8]。
miRNA是非编码的短RNA，进化上高度保守，广泛存在于动植物中，其主要功能是特异性结合靶mRNA，抑制靶mRNA表达，在转录后水平对基因的表达进行调控，在炎症、免疫和不同的肺损伤中具有多种生物学功能。miRNA可多效性地面向100～1 000个基因，并在细胞或器官中以特异性的方式发挥作用。一种miRNA可以调节患者体内的几种生物通路。由于其敏感性、特异性和可及性，miRNA被认为是一种理想的生物标志物。有研究已经对miRNA在脓毒症中的作用进行了研究，并证实了脓毒症患者中特定miRNA及其靶点的改变[9]。许多研究表明[10]，多种miRNAs直接靶向肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)通路，这是脓毒症中促炎过程的主要调节因子；
此外，miRNAs通过靶向toll样受体(TLR)/核因子-κB(Nuclear transcription factor-kappa B, NF-κB)信号通路在脓毒症调控中发挥功能作用。其中，TLR4被细菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)激活。因此，被认为与脓毒症最相关,见图2；
同时，miRNA调控了脓毒症相关基因的表达，如白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、TNF等，并被这些因子调控自身的表达,见图3[10]，凸显了miRNA在脓毒症病理生理中的深度整合。既往研究也证实了miRNA表达水平与脓毒症患者死亡率之间的相关性[11]。尚有研究报道miRNA可用于表明病理的存在，及其分期、进展和不同疾病发病机制的遗传联系[12-15]。此外，miRNA水平的改变可以区分脓毒症的不同病理阶段[16]；
尚可对处于不同病理生理阶段的病人提供新颖有效的治疗策略[17-19]。
1.1 miRNA在脓毒症急性肺损伤中的作用
脓毒症引起的急性肺损伤是脓毒症最为严重的一种症状。研究表明过表达miR-574可抗凋亡活性，抑制炎症反应，抑制ERS作用；
上调miR-574以减轻脓毒症急性肺损伤可能是通过促进补体C3下调和减轻ERS实现的[20]。脓毒症时，循环中大量细胞受到刺激，如血小板、血管内皮细胞与白细胞等，随后可分泌微泡(Microvesicles，MVs)，其中内皮细胞MVs(Endothelial MVs,EMVs)通过转运功能性miR-23b在脓毒症时肺血管渗漏和肺损伤中发挥重要作用，通过拮抗EMVs及其miR-23b的分泌，可减轻血管渗漏和肺损伤[21]。Wu等[22]研究发现LPS诱导脓毒症小鼠的miR-181a上调，沉默信息调节因子1(Sirtuin 1,SIRT1)下调，并产生强烈的炎症反应，抑制核转录因子E2相关因子2的表达，激活NF-κB通路；
抑制miR-181a可减轻LPS诱导的炎症反应和凋亡，这可能是通过上调其靶点SIRT1表达实现的。尚有研究表明环状RNA circC3P1过表达可通过下调miR-21降低细胞凋亡和促炎细胞因子水平治疗脓毒症急性肺损伤[23]。
1.2 miRNA在脓毒症急性心肌损伤中的作用
脓毒症急性心肌损伤是导致脓毒症死亡的主要原因，其发生机制可能与心肌细胞凋亡、线粒体功能障碍和细胞外炎症浸润等有关。研究发现，过表达的miR-132-3p通过抑制髓样分化蛋白88/NF-κB通路实现抗脓毒症心肌损伤的作用[24]。
1.3 miRNA在脓毒症急性肾损伤中的作用
急性肾损伤作为脓毒症常见合并症之一，会加重脓毒症病情，甚至增加病死率，而肾小管上皮细胞损伤被认为是引起脓毒症急性肾损伤的重要因素。研究发现，miR-29a通过靶向信号转导和转录激活子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)减轻脓毒症肾小管上皮细胞炎症反应及凋亡[25]。此外，1项162例脓毒症并发急性肾损伤患者的随机对照观察显示，miR-146a与病情的严重程度及预后相关，对预测该类患者的28 d死亡率有较高价值[26]。此外，miR-15a-5p、miR-192-5p、miR-155-5p、miR-486-5p和miR-423-5p均被证实是脓毒症急性肾损伤的生物标志物或治疗靶点[27]。
1.4 miRNA在脓毒症肝损伤中的作用
脓毒症并发肝损伤是脓毒症患者死亡的独立危险因素，其机制可能为微循环低灌注、缺血缺氧性损伤和肝窦内皮细胞功能紊乱等[28]。miR-122a参与脓毒症肝损伤患者的损伤过程，是评估脓毒症肝损伤预后和死亡的敏感指标之一[29]。
针灸疗法在脓毒症的治疗中具有积极作用，该作用并不在于直接杀菌、灭毒，而在于对炎症反应及免疫功能的调节和对多器官功能的保护。研究表明[30]，神经系统、内分泌系统与免疫系统之间的相互协调对于炎症反应的调节十分重要，而对“神经-内分泌-免疫网系统”的积极调节作用是针灸抗炎的关键生物学基础。炎性反应信息由迷走神经传入中枢(相关脑区主要有迷走背核、孤束核等)，加工整合后，再下行至植物神经系统及下丘脑-垂体-肾上腺系统，进一步调节和控制炎性反应。此外，针灸还具有双向良性调节、饱和调节和多靶点调节的特点，但这些优势又受到机体自稳态机制对针灸干预的整合与利用的影响[31]。
席卷全球的新型冠状病毒肺炎患者继发全身性炎性反应，出现脓毒症休克是新型冠状病毒重症肺炎的重症并发症。2020年2月8日，中国针灸学会发布了《新型冠状病毒肺炎针灸干预的指导意见》，推荐疑似病例、轻症和普通型患者以及恢复期患者使用灸法治疗[32]。此外，有大量的循证医学证据表明针灸可以治疗炎性反应性疾病，许多动物实验及随机对照试验亦验证了针灸治疗脓毒症的确切疗效。而且已经证实，针灸尤其是电针治疗脓毒症的作用机制是激发迷走抗炎途径及调节免疫系统[33]。
2.1 针灸对炎症反应的影响
针灸疗法对脓毒症患者的炎性因子具有调节作用。电针足三里穴可降低脓毒症患者急性生理与慢性健康评分(Acute physiology and chronic health evaluationⅡ, APACHEⅡ)、C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)、降钙素原(Procalcitonin,PCT)和血清乳酸，升高CD4+、CD8+含量，可调节体内抗炎与促炎反应趋向平衡，从而降低MODS的发生率和病死率，改善脓毒症预后，其机制可能与电针足三里减少体内促炎和抗炎介质释放有关[34]。1项108例的大样本随机对照试验(Randomized controlled trial,RCT)发现在常规治疗基础上，接受针刺足三里3 d治疗的脓毒症患者，炎性反应因子血清PCT、血乳酸、APACHEⅡ评分及全身性感染相关器官功能衰竭评分(SOFA)等相关指标均显著降低[35]。结合笔者及团队的前期临床研究表明，电针可降低气管切开插管患者临床肺部感染评分，促进肺部感染的恢复[36]，改善肺部的换气功能[37]；
前期实验研究表明[38]，电针可降低基底节脑出血动物模型的白细胞计数，改善肺部的组织病理形态，均说明电针具有一定的抗炎作用。
2.2 针灸对免疫功能的调节
脓毒症的致病机制复杂，其中免疫调节失衡是其重要原因。因此，及时改善免疫抑制是脓毒症的治疗重点。针灸疗法能够明显改善脓毒症患者的免疫功能，升高CD3+、CD4+、CD8+、IgG、IgA及IgM含量，缩短ICU住院时间，降低再次住院率及28 d病死率[39]。
2.3 针灸对多器官功能的保护
针灸疗法对于脓毒症患者的胃肠功能具有积极的保护作用，可改善腹腔内压、胃残余量[40]。2019年的1项大样本RCT试验比较了118例脓毒症胃肠功能障碍患者接受针刺治疗的疗效差异，发现在第6天和第10天针刺组胃肠功能障碍评分、炎性反应指标计数均明显低于对照组，针刺治疗可明显改善肠道通透性及血液循环，有助于早期实现目标喂养[41]。
此外，电针能显著抑制脓毒症大鼠心肌炎性反应促炎因子的水平发挥心肌保护作用[42]。电针百会、水沟穴能有效改善脓毒症相关性脑病患者的脑损伤，提高临床疗效[43]。
电针还可以通过激活PI3K/Akt/Nrf2信号通路，上调血红素加氧酶的表达，从而抑制促炎因子的释放、减少中性粒细胞的聚集，来减轻内毒素休克诱发急性肺损伤时的炎性反应，达到肺保护的作用[44]。电针双侧内关、足三里穴可通过Janus蛋白酪氨酸激酶1/STAT3通路减轻脓毒症大鼠急性肺损伤，抑制脓毒症大鼠炎性介质的释放及细胞凋亡[45]。
研究表明，电针可通过降低miRNA-133a改善脓毒症心肌损伤患者APACHEⅡ评分、肌钙蛋白，调节抗凋亡因子Bcl-2、促凋亡因子caspase-3、TNF-α及IL-6，提高左心室射血分数(LVEF)，起到保护心肌损伤作用[46]。电针尚可通过上调miR-146a激活胆碱能抗炎通路，降低促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及高迁移率族蛋白-1水平，从而提升脓毒症小鼠生存率，减轻全身炎症反应和脏器损伤[47]，效果显著。
脓毒症隶属于中医外感发热范畴[48]，因热毒邪入营血，瘀滞于脉，侵袭脏腑，气血津液不足，不能濡养脏腑及四肢百骸，致脏腑精气虚衰。针灸这一传统治疗手段在脓毒症中的运用不仅是对中华传统医学的继承与发扬，更为脓毒症的治疗开辟了新的方向。
针灸对机体生理、病理过程具有多系统、多脏器与多靶点的整体综合性干预特点，在体内可引起包括基因、蛋白与代谢等多个层面的反应，是预防和治疗脓毒症的方法之一，而大量研究表明miRNA通过调控靶基因表达影响脓毒症相关信号通路，在脓毒症的不同病理阶段发挥重要生物学作用，是基因表达调控网络中的关键一员，也是目前很有前景的一类新的生物学标志物，可作为判断脓毒症预后的新靶点，因此基于miRNA研究针灸在脓毒症中的治疗作用可能是阐明针灸治疗脓毒症作用机制的有效手段，借助基因组学的相关方法和技术，将有助于进一步深入、系统地揭示针灸治疗脓毒症的分子生物学机制。
然而，目前从miRNA角度观察针灸治疗脓毒症的报道不多。很多miRNAs均能在脓毒症的诊治中发挥作用，今后的研究可以多从这些方面入手，以针灸为干预手段观察不同miRNA在脓毒症中的变化，从而从基因水平为针灸领域的研究提供更多证据，以期进一步明确针灸的作用机制。但仍有一些问题尚待解决。目前基于miRNA-脓毒症的文献研究发现体外细胞培养较多、实验动物的在体实验较少，而研究针灸的作用机制势必要在活体动物上进行操作，有关miRNA的抑制剂或生物类似物的体内注入并没有统一公认的剂量规范，亦缺乏对miRNA的抑制剂或生物类似物的作用时效研究，对其死亡率及成功率尚未有明确的循证医学证据。此外，基于针灸的一些基础科学问题，比如针灸的干预方式、刺激量、穴位特异性、腧穴配伍及穴位敏化研究等，仍需进行多中心、大样本的随机双盲临床观察及动物实验研究，增加可比性、可重复性，通过miRNA表达调控的研究等，从转录调控层面更深入加强对针灸作用规律和物质基础的认知，进一步挖掘针灸的调控机制并发现治疗脓毒症的新靶点。
此外，脓毒症不同的病理进程及不同器官的功能损伤其介导的miRNA可能不尽相同，所采用的针灸干预方式及腧穴配伍选择亦会有所差异，目前国内外尚无统一的针灸治疗脓毒症的评判标准，仍需借助基因数据库等生物信息技术筛选并验证符合该病理阶段及该器官功能的特征miRNA，并制定出特质化的优化方案，全程、动态和全方位地把握针灸治疗脓毒症在不同时期、不同脏器的效应规律和机制，并尽可能探索其内在的相互作用关系，为针灸治疗脓毒症的临床应用及推广提供坚实可靠的科学依据。
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