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梁世濠，谭可宜，刘泳琪，周苏斌，黄霭珺，司徒文贝
（华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）
活性功能因子因对机体有明显的调节和保护作用而被大众所喜爱，但由于加工储藏过程水分、压力以及人体消化道pH值、消化酶的影响，活性功能因子需要一定的载体材料进行保护，才能确保其生理作用的发挥[1]。Pickering乳液是以超细粒子作为乳化剂而得的乳状液，粒子吸附于油水界面可稳定界面层，在功能因子保护与递送方面有重要作用，是一种新型的包载体系[2]。组成Pickering乳液的胶体粒子极为重要，目前天然多糖、大豆蛋白、小麦蛋白、纳米纤维素等常用作Pickering乳液的制备材料[3-6]。
在淀粉基载体材料中，改性淀粉、淀粉/脂复合物、淀粉/多糖复合物、淀粉纳米晶等均可用于Pickering乳液的制备[2，7-9]。玉米淀粉、小米淀粉、芋头淀粉、藜麦淀粉等也曾被选用，进行酯化改性，制得Pickering乳液[10-13]。辛烯基琥珀酸淀粉酯（octenyl succinic anhydride starch，OSA-St）由于辛烯基琥珀酸基团的引入，而带有一定的电荷，能在溶液中形成胶束，常用作微胶囊壁材、乳化稳定剂等[14]。有研究发现，辛烯基琥珀酸淀粉酯的乳化性随着酯化取代度的提高而不断增大，进而影响其作为微胶囊壁材的乳化性能[15]。李志坤[7]曾利用不同晶型的原淀粉，制备OSA-St及其Pickering乳液，结果发现，具有A型结晶结构的马铃薯淀粉制得的OSA-St乳化性能更好，形成的Pickering乳液更稳定。由此可见，受原淀粉结构的影响，改性淀粉的结构性能也会有所差别，进而影响其Pickering乳液的包载、递送性能。但从淀粉的链结构、层状结构到其聚集体结构有多种的变化可能，以此为基础，全面探讨淀粉基Pickering乳液的研究较少。
针对原淀粉分子结构差异对淀粉基Pickering乳液性能的影响，本文选用支叉结构有差异的蜡质玉米淀粉和普通玉米淀粉，配合高温降解手段，分别制备OSA-St及其Pickering乳液，利用现代分析仪器，研究淀粉基载体材料分子结构，探讨材料微观结构对Pickering乳液性能、控释行为的作用机制，为稳定的Pickering乳液制备及其释放性能调控提供参考，也为合理利用淀粉基载体材料提供参考。
1.1 材料与试剂
辛烯基琥珀酸酐（octenyl succinic anhydride，OSA）（分析纯）：广州化学试剂厂；
普通玉米淀粉、蜡质玉米淀粉：河北古松农副产品有限公司；
玉米油：嘉里粮油（中国）有限公司；
α-淀粉酶（12 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/g）、胰蛋白酶（4 000 U/g）、糖化酶（100 U/mg）：广东皖冬生物科技有限公司；
其它试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
ME204/02红外水分测定仪：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；
MCR502流变仪：奥地利安东帕公司；
Scientz-D超声波细胞破碎仪：宁波新芝生物科技有限公司；
Vertex 70傅里叶红外光谱仪：美国布鲁克公司；
DV2T黏度计：美国博勒飞公司；
ZS90纳米粒度及Zeta电位分析仪：英国马尔文仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 OSA-St的合成与降解
称取8.0 g淀粉（干基）溶于200 mL蒸馏水，控制温度35℃，用2%氢氧化钠调节淀粉乳pH值至9.0，分别滴加 0.7、1.4、2.1、2.8、3.5、5.0、6.5 g 和 8.0 g OSA，并立即计时，反应过程中持续滴加2%氢氧化钠，维持反应体系pH值为9.0，反应4 h后加入冰醋酸调节反应体系pH值至7.0，结束反应。淀粉乳液用布氏漏斗抽滤，获得滤饼，并水洗3次，45℃烘干12 h，粉碎过100目筛，备用。用酸碱滴定法测定OSA-St的取代度（degree of substitution，DS）[15]，取代度计算公式如下。
式中：0.162为葡萄糖残基的摩尔质量，g/mmol；
0.21为辛烯基琥珀酸酐的摩尔质量，g/mmol；
A为每克辛烯基琥珀酸淀粉酯消耗0.1 mol/L氢氧化钠的物质的量，mmol；
c为氢氧化钠的浓度，0.1 mol/L；
V 为消耗0.1 mol/L氢氧化钠的体积，mL；
w为辛烯基琥珀酸淀粉酯样品的质量，g。
根据原淀粉来源不同，蜡质玉米淀粉（Waxy）和普通玉米淀粉（Corn）制得的辛烯基琥珀酸淀粉酯，分别命名为OSA-Waxy和OSA-Corn。当辛烯基琥珀酸淀粉酯DS分别为0.01、0.02、0.03时，对应的淀粉样品分别命名为 OSA-Waxy-0.01、OSA-Waxy-0.02、OSA-Waxy-0.03 和 OSA-Corn-0.01、OSA-Corn-0.02、OSA-Corn-0.03。
称取适量OSA-St在150℃下进行热降解2 h，得到高温降解的淀粉样品[15]，根据原淀粉不同，分别命名为OSA-Waxy-HD和OSA-Corn-HD。当淀粉样品DS为0.01、0.02、0.03时，具体的淀粉样品命名为OSAWaxy-1-HD、OSA-Waxy-2-HD、OSA-Waxy-3-HD 和OSA-Corn-1-HD、OSA-Corn-2-HD、OSA-Corn-3-HD。未经任何处理的原淀粉，按淀粉来源分别命名为Native-Waxy和 Native-Corn。
1.3.2 OSA-St的结构性能测定
1.3.2.1 OSA-St的链结构测定
上述制备的淀粉样品，其链结构运用傅里叶红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）进行测定。试验采用溴化钾压片法测定。将样品与一定量溴化钾混合、研磨、压片，以空气为背景，扫描范围为 4 000 cm-1～ 600 cm-1，分辨率为 4 cm-1，扫描 16 次，所得谱图进行基线校正处理。
1.3.2.2 OSA-St的黏度测定
对于上述制备的淀粉样品黏度进行测定，将OSA-St配制成一定浓度的淀粉乳，经沸水浴糊化30min后，在25℃下，利用黏度计，在转速30 r/min下测定其黏度。
1.3.3 淀粉基Pickering乳液的制备与性质测定
称取0.002 g OSA-St溶于2 mL蒸馏水中，加入105 μL玉米油，并用超声波细胞破碎仪超声2 min，使乳液均匀、无沉淀，制成Pickering乳液。将制得的Pickering乳液用去离子水稀释至浓度为1%，分散均匀后测定粒径及Zeta电位。
1.3.4 淀粉基Pickering乳液的消化性能测定
参考余振宇[12]的方法，制备口腔消化模拟液（simulated saliva fluid，SSF）、胃消化模拟液（simulated gastric fluid，SGF）和小肠消化模拟液（simulated intestinal fluid，SIF）。取4 mL乳液样品于离心管，加入4 mL SSF，混合、调节混合液pH值为6.8，加入0.5 mL溶有α-淀粉酶（11.6 mg/mL）的溶液，37℃、100 r/min振荡10 min，以模拟口腔消化。取10 mL经过模拟口腔消化10 min后的消化液，调整pH值至1.5，加入5 mL SGF及胃蛋白酶溶液（64 mg/mL），37℃、100 r/min振荡 1 h，以模拟胃液消化。乳液样品经过模拟胃液消化后，调节pH值至7.0，加入15 mL SIF及0.5 mL含有胰蛋白酶（66 mg/mL）和糖化酶（42 mg/mL）的溶液，37℃、100 r/min条件下振荡，以模拟小肠消化[12]。在消化过程 10、40、70 min 和 120 min，滴入 0.2 mol/L NaOH 溶液，维持溶液pH值为7.0，以滴定消耗的NaOH溶液体积，按下列公式计算乳液游离脂肪酸（free fatty acids，FFA）释放率。
式中：Vt为时间t所消耗的NaOH溶液体积，mL；
C为NaOH浓度，0.1 mol/L；
M油脂为油脂的平均分子质量，g/mol；
M乳液为乳液中油脂质量，g。
1.3.5 数据分析
采用SPSS 21.0软件分析数据，数据差异性采用单因素方差分析处理，p＜0.05表示具有显著差异，试验重复3次。
2.1 OSA-St的合成与表征
不同酸酐用量对OSA-St取代度的影响见图1。
由图1可知，在合成过程中，OSA-St的DS随着OSA添加量的增加呈先上升后下降的趋势，当辛烯基琥珀酸酐用量从0.7 g增加6.5 g，淀粉OSA-Waxy的DS从0.004逐渐增至0.064，淀粉OSA-Corn的DS从0.006逐渐增至0.042。
因为辛烯基琥珀酸酐用量的增加使淀粉分子与OSA之间的结合增加，促进酯化取代反应的进行，淀粉分子上更多的羟基被取代，从而使DS增大[14]。另外，淀粉OSA-Corn的DS值在OSA添加量为3.5 g时达最大值，淀粉OSA-Waxy的DS在OSA添加量为6.5 g时达最大值。这是由于蜡质玉米淀粉的支链含量高，可提供更多的参与酯化反应的作用位点[15]。
对淀粉样品的链结构进行分析，不同辛烯基琥珀酸淀粉酯的FTIR见图2。
由图2可知，蜡质玉米淀粉和普通玉米淀粉均在波数为3 500 cm-1处有特征吸收峰，这是由葡萄糖基上O-H的伸缩振动和C-H的伸缩振动生成的；
此外，原淀粉颗粒在波长1 750 cm-1处有特征吸收峰，分析这是由淀粉中残存的结合水导致；
原淀粉颗粒在波数为929 cm-1和1 157 cm-1处均有特征吸收峰，分析是由C-O的伸缩振动导致的[14]。
与原淀粉相比，OSA-Waxy和OSA-Corn在1727cm-1和1 574cm-1处均出现了新的特征峰，分析1 574 cm-1处特征峰的出现是由于RCOO-的不对称伸缩振动产生，1 727 cm-1处特征峰的出现是由位于酯羰基C＝O的伸缩振动产生，表明OSA基团与淀粉发生了酯化反应。且随着DS的升高，C＝O的伸缩振动峰的峰强升高。
2.2 高温降解对OSA-St分子结构的影响
高温降解对OSA-St分子结构的影响见图3。
由图3可知，尽管淀粉原料有差异，但不同DS的OSA-St经高温降解处理后在1 724 cm-1处仍出现C＝O伸缩振动吸收峰，并且此峰的强度随着DS的提高而增强。同时，在1 637 cm-1和578 cm-1处分别出现了C＝C对称伸缩振动吸收峰和-CH2-CH2-的伸缩振动吸收峰，且强度随着DS的提高而增强。与高温降解前相同DS的OSA-St红外特征吸收峰相同，表明在淀粉分子链中引入的OSA基团，不会在高温降解过程中发生改变和脱落[14]。
淀粉作为乳液的载体材料，其尺寸结构对乳液的性能有着重要影响。OSA基团具有一定的空间位阻，可增大改性淀粉材料的分子移动阻力，同时，高温降解会使淀粉分子链发生断裂，不同的链段长短，均会引起淀粉乳液的黏度改变。高温降解前后OSA-St乳液的黏度变化见图4。
由图4A可知，与原淀粉相比，酯化改性使淀粉乳液黏度的增大，其中，淀粉OSA-Waxy的DS达0.02时，淀粉乳液黏度达最大值，OSA-St在碱性条件下合成，淀粉结晶区域被水解，更多的淀粉链段参与反应，而OSA-St中引入长碳链基团后，OSA基团的空间位阻降低淀粉分子链段的移动性，使淀粉乳液黏度增加。对于不同淀粉原料得到的OSA-St，由于蜡质玉米淀粉中支链淀粉含量高，淀粉支叉结构具有一定的空间体积，呈“簇状”[14]，淀粉OSA-Waxy的黏度高于淀粉OSA-Corn。
而高温降解后的OSA-St黏度均大幅度降低，需增大淀粉乳液的浓度以测定其黏度（图4B）。高温处理过程中，淀粉分子链断裂，分子量急剧降低，形成的分子链较短，削弱了分子链间的氢键作用，淀粉分子链在乳液中游移的阻力降低，从而降低淀粉乳液的黏度[15]。高温降解，淀粉分子链随机断裂，与支链淀粉含量相对较低的普通玉米淀粉相比，OSA-Waxy-HD仍保留有一定的支叉结构，从而使OSA-Waxy-HD淀粉乳液的黏度较高[15]。DS在0.01～0.02时，OSA-Waxy-HD均高于淀粉OSA-Corn-HD，当DS为0.03时，OSA-Corn-HD的黏度则高于OSA-Waxy-HD，这是由于DS增大，OSA-Corn-HD的淀粉分子链段受OSA基团空间位阻的影响，分子链段移动的阻力增加，因此，DS升高后，OSA-Corn-HD的黏度高于OSA-Waxy-HD。
2.3 淀粉基Pickering乳液的粒径、表面带电情况
淀粉基Pickering乳液的粒径、表面带电情况见图5。
由图5A可知，两种淀粉基的Pickering乳液粒径随着DS的增加而逐渐减小，OSA-Corn-HD Pickering乳液的变化较为明显。当淀粉酯的DS分别在0.01、0.02和0.03时，OSA-Waxy-HD Pickering乳液粒径分别为 268.7、262.6、248.5 nm，而 OSA-Corn-HD Pickering乳液粒径分别为436.9、298.1、290.1 nm。
在改性过程中，淀粉分子引入带长碳链的OSA基团可形成疏水界面，随着DS的增加，淀粉颗粒表面疏水性增强，淀粉颗粒陷入油滴中的体积增加，增大淀粉颗粒与油滴的接触面积，从而稳定Pickering乳液液滴所需的颗粒更少，因此Pickering乳液液滴的粒径更小[16]。由图5B可知，OSA-Waxy-HD和OSA-Corn-HD的Pickering乳液均带负电，且随着DS提高，表面电荷增大。当淀粉酯的DS分别在0.01、0.02和0.03时，OSA-Waxy-HD Pickering乳液电位分别为-26.6、-29.4、-33.4 mV，而OSA-Corn-HD Pickering乳液电位分别为-26.9、-31.6、-36.0 mV。这与OSA-St在碱性条件下合成含带负电的烯基基团，致使淀粉基Pickering乳液带负电有关[17]。
2.4 淀粉基Pickering乳液的消化性能
乳液经过SSF和SGF后进入SIF消化，在小肠阶段消化、产生FFA。淀粉基Pickering乳液的消化性能见图6。
由图6可知，消化时间为10 min时，随着DS的增加，OSA-Corn-1-HD、OSA-Corn-2-HD、OSA-Corn-3-HD的FFA释放率分别为21.43%、25.71%、30.00%；
OSA-Waxy-HD的FFA为21.43%，在消化初期（10min）FFA的释放率迅速增加。消化时间为40 min和70 min时，同一取代度的OSA-Corn的FFA释放率比OSA-Waxy快。在120min时，随着DS提高，OSA-Corn-1-HD、OSACorn-2-HD、OSA-Corn-3-HD的FFA释放率分别为42.86%、45.00%、47.14%；
OSA-Waxy-1-HD的FFA释放率为42.86%，其余两组均为47.14%。
在模拟消化液中，淀粉基Pickering乳液的FFA释放受各种消化酶影响。其中，Pickering乳液在模拟消化液中与消化酶接触，相同条件下，随着DS的提高，乳滴粒径变小，更有利于酶的结合，从而促进油脂的消化，乳液的FFA释放量增加[18-19]。受淀粉基Pickering乳液表面的负电荷影响，随着DS增加，乳液液滴之间静电排斥更大而不易聚集，从而也增大了乳液液滴与酶的结合作用[20]。但是，淀粉基Pickering乳液的FFA释放也与pH值变化有关。在消化过程中，淀粉基Pickering乳液在口腔中停留时间较短，淀粉材料虽受淀粉酶的作用，但淀粉基Pickering乳液仍保持原有的粒径与形态。在胃液中由于高离子强度和低pH值，H+与带负电荷的Pickering乳液间发生作用，引起Pickering乳液不稳定。DS较小的淀粉基Pickering乳液容易因表面电荷情况改变而发生聚集，高DS的Pickeirng乳液因静电排斥更大而更稳定。在进入模拟小肠液后，聚集的淀粉基Pickering乳液随聚集程度增大，粒径增大，比表面积减小，从而减缓了FFA的释放量[21]。所以，此阶段高DS的淀粉基Pickering乳液受前一阶段的静电排斥作用影响，比表面积较大而有利于胰脂肪酶的结合，进而释放更多FFA。
同时，受淀粉基材料的消化性能影响，不同的淀粉基Pickering乳液的控释性能有所差异。在淀粉分子结构中成功引入OSA基团后，OSA基团可形成一定空间位阻，阻碍淀粉酶与淀粉的结合，抑制淀粉酶对淀粉的降解，因此，随着DS的增加，淀粉抗消化能力增强，有利于提高淀粉基Pickering乳液的稳定性[22]。对比两种淀粉原料，OSA-Waxy-HD的支链淀粉含量更高，淀粉酶对直链淀粉中α-1，4-糖苷键的水解速率要高于支链淀粉的α-1，6-糖苷键，受淀粉酶解速度的影响，OSA-Corn-HD Pickering乳液释放FFA速度比OSAWaxy-HD Pickering 乳液更快[23]。
结合淀粉材料的结构及淀粉基Pickering乳液性能的分析，选择具有一定支叉结构的淀粉基材料，有利于脂溶性功能因子高效生物利用。同时，在模拟消化过程中，可避免脂溶性成分的快速释放与消化，为脂溶性功能因子胃肠道靶向控释提供基础。
为实现功能因子的生物高效利用，探讨OSA-St的分子结构差异对其Pickering乳液性能的影响，本研究制备一系列的OSA-St，通过调整酸酐用量及高温降解、调控淀粉材料的分子结构，为淀粉基Pickering乳液的稳定提供基础。结果表明，随着DS的增加，淀粉基Pickering乳液粒径减小、表面负电荷增多。同时，受原淀粉分子结构及性能影响，支叉结构数量较多的OSA-Waxy-HD形成的Pickering乳液稳定性不佳。另外，在乳液消化过程中，随DS的增加，淀粉基Pickering乳液的带电性提高，颗粒尺寸下降，可有效避免脂溶性成分在胃肠道的快速释放，为脂溶性功能因子胃肠道靶向控释提供基础。
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