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郭 星，王乾蕾，王 斌，窦 月，王永凤
（1. 中山市食品药品检验所，广东 中山 528437；
2. 广州市香雪制药股份有限公司，广东 广州 510530）
《中华人民共和国药典临床用药须知》[1]中介绍：清肝利胆口服液常用于清利肝胆湿热，尤其对湿热蕴结肝胆所致的纳呆、胁痛、疲倦、乏力、尿黄、苔腻、脉弦有明显疗效。方中茵陈清利湿热，利胆退黄，为君药。山银花清热解毒、疏散风热，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、免疫和保肝利胆等功效[2-3]；
栀子清热泻火；
二者助茵陈加强清利肝胆湿热之效，为臣药。厚朴行气化湿；
防己利水消肿，能使肝胆湿热从小便而出，为佐药。诸药合用，共奏清利肝胆湿热之功。有研究表明，清肝利胆口服液发挥保肝利胆的作用可能与抗炎、免疫调节、细胞色素P450代谢和血糖调节相关[4]。
现行版药典[5]中，清肝利胆口服液的标准仅以栀子苷为指标进行含量测定，不能全面反映药品内在质量。目前国内外未见清肝利胆口服液成方中的山银花和防己专属有效成分的含量研究。
山银花含绿原酸等有机酸、黄酮类、三萜皂苷类等主要活性成分[6]。亦有研究在山银花中发现积雪草酸[7]。娄玉霞等[8]建立高效液相色谱法（HPLC）测定7种成分的含量，取得较好结果。防己中多个化学成分能影响痛风性关节炎的凋亡、炎症、血管新生及尿酸清除过程，可用于治疗痛风性关节炎[9]。现代研究表明，粉防己碱在抗癌及抗肿瘤方面[10-11]、防己诺林碱在抗癌方面[12]均发挥一定作用。根据目前研究，清肝利胆口服液中尚缺防己的特征成分及山银花中三萜皂苷类特征成分的定量分析和控制。
为精准考察药品质量，确保疗效稳定，本文建立高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLCELSD）测定清肝利胆口服液中臣药山银花专属成分绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙的含量，建立高效液相色谱-二极管阵列检测器法（HPLC-DAD）测定清肝利胆口服液中佐药防己专属成分粉防己碱、防己诺林碱的含量，为全面评价清肝利胆口服液的质量提供参考。
1.1 仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；
XS205DU电子分析天平（美国梅特勒-托利多公司）。
1.2 对照品、样品及试剂
对照品绿原酸（批号110753-202018，含量96.1 %），灰毡毛忍冬皂苷乙（批号111814-202005，含量97.2 %），川续断皂苷乙（批号111813-201804，含量96.8 %），粉防己碱（批号110711-201810，含量99.6 %），防己诺林碱（批号110793-200605，含量100.0 %），均来自中国食品药品检定研究院；
清肝利胆口服液5批（规格10 ml/瓶，广州香雪）；
甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2.1 色谱条件
2.1.1 山银花特征成分的HPLC-ELSD色谱条件色谱柱：Waters SunFire C18（4.6 mm×250 mm，5 µm），以乙腈为流动相A，以1 %冰醋酸溶液为流动相B，按表1中程序进行梯度洗脱。流速1.0 ml/min，柱温30 ℃, 漂移管温度60 ℃，增益2，载气氮气，气体流速2 L/min，进样量10 μl。
表1 关于山银花特征成分的流动相梯度洗脱表
2.1.2 防己特征成分的HPLC-DAD色谱条件 色谱柱：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5µm），以乙腈为流动相A，以0.08 %三乙胺水溶液为流动相B，按表2中程序进行梯度洗脱。流速1.0 ml/min，柱温30 ℃，紫外检测波长280nm，进样量10 μl。
表2 关于防己特征成分的流动相梯度洗脱表
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品储备液 精密称取绿原酸对照品约46.7 mg、灰毡毛忍冬皂苷乙对照品约159.6 mg、川续断皂苷乙对照品约20.2 mg，置入250 ml量瓶，加70 %甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1 ml各含179.6，620.7，78.4 μg溶液，作为测定山银花特征成分的对照品储备液。
精密称取粉防己碱对照品约79.0 mg、防己诺林碱对照品约105.7 mg，置入100 ml量瓶，加50 %甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1 ml各含786.8，1057.0 μg溶液，作为测定防己特征成分的对照品储备液。
2.2.2 供试品溶液 精密量取清肝利胆口服液1 ml，置入20 ml量瓶，加70 %甲醇定容至刻度，摇匀，作为测定山银花特征成分的供试品溶液。精密量取供试品5 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为测定防己特征成分的供试品溶液。
2.2.3 阴性样品溶液 按照清肝利胆口服液的处方比例，制备山银花阴性样品和防己阴性样品。按2.2.2项方法制备相应阴性供试品溶液。
2.3 专属性试验
精密量取2.2项下山银花特征成分相关的溶液各10 μl，按2.1.1项色谱条件测定，结果见图1；
精密量取2.2项下防己特征成分相关的溶液各10 μl，按2.1.2项色谱条件测定，结果见图2。在上述色谱条件下，清肝利胆口服液中5个被测成分均达到基线分离，与其他成分之间均无明显干扰。
图1 山银花专属性色谱图
图2 防己专属性色谱图
2.4 线性关系考察
精密量取山银花特征成分的对照品储备液2，5，10，15，20，30，50 μl，按2.1.1项色谱条件测定，进样量（g）对数X为横坐标、峰面积对数Y为纵坐标进行回归分析，见表3。
表3 5个成分的线性关系结果
精密量取防己特征成分的对照品储备液适量，用50 %甲醇逐级稀释20，100，150，200，400，1000，2000 倍，制成不同浓度的对照品溶液，按2.1.2项色谱条件测定，进样量X（μg）为横坐标、峰面积Y为纵坐标进行回归分析，见表3。
2.5 精密度试验
吸取山银花特征成分的对照品储备液和防己特征成分的对照品储备液，按2.1项色谱条件，重复进样6 次，测得绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、粉防己碱、防己诺林碱的峰面积RSD依次为 0.35 %，0.11 %，0.64 %，0.48 %，0.71 %，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验
取同一供试品溶液，由不同分析人员，在室温下，分别于0，2，4，6，8，12，32，82 h，按2.1项色谱条件，测得绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、粉防己碱、防己诺林碱的峰面积RSD依次为2.36 %，1.46 %，2.01 %，0.96 %，1.17 %，表明供试品溶液在82 h内稳定性良好。
2.7 重复性试验
取同一批清肝利胆口服液按2.2.2 项方法制备6 份供试品溶液，按2.1项色谱条件测定，绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙平均值分别为2.58，8.26，0.92 mg/ml，粉防己碱、防己诺林碱平均值分别为32.90，121.11 μg/ml，RSD依次为1.66 %，1.50 %，0.43 %，0.69 %，1.88 %，结果表明，该方法重复性较好。
2.8 加标回收率试验
2.8.1 山银花特征成分的加标回收试验 精密量取6份已知含量的同一批号清肝利胆口服液，每份0.5 ml，分别置入20 ml量瓶，精密加入对照品溶液适量，加70 %甲醇定容，摇匀，按2.1.1项色谱条件进样，结果见表4，表明回收率良好。
表4 3种成分的加样回收率
2.8.2 防己特征成分的加标回收试验 精密量取6份已知含量的同一批号清肝利胆口服液，每份2.5 ml，分别精密加入对照品溶液适量，置入10 ml量瓶，加甲醇稀释定容，摇匀，按2.1.2项色谱条件进样，结果见表5，表明回收率较好。
表5 2种成分的加样回收率
2.9 样品含量测定
取清肝利胆口服液样品，按2.2项方法制备、2.1项色谱条件进样，清肝利胆口服液中5种成分含量测定结果见表6。
表6 清肝利胆口服液中5种成分的含量
在现行清肝利胆口服液质量标准中，仅以栀子苷为指标进行定量质控，不能全面反映该制剂中多组分共同作用起效的特点，本试验尝试多种方法研究君药茵陈的指标成分，除薄层鉴别茵陈方法，经对比山银花阴性样品和茵陈阴性样品色谱峰面积发现，该制剂中茵陈所含绿原酸的量极少，可忽略不计；
采用液相色谱法测定清肝利胆口服液中茵陈指标成分的方法有待进一步研究。故本研究以清肝利胆口服液处方中臣药山银花、佐药防己的特征成分作为质量评价指标。通过方法学研究，建立了相应成分的含量测定方法。
研究发现，绿原酸和三萜皂苷类溶解在70 %甲醇中3 d内稳定性较好，防己专属碱类成分溶解在甲醇中2 d内稳定性较好。
考察水和不同比例的甲醇对有效成分的提取率，结果表明，用70 %甲醇提取山银花特征成分效果较好，用甲醇提取防己特征成分效果较好。
比较了多种品牌各种型号的C18色谱柱，结果表明，本文中测定的5种成分基本能在不同的C18色谱柱中分离，但臣药山银花特征成分中的三萜皂苷类在Waters SunFire C18（4.6 mm × 250 mm，5 µm）分离效果较好，佐药防己特征成分在不同品牌的C18色谱柱中分离效果区别不大。
考察流动相中酸和碱的种类和比例，结果表明，乙腈-1 %冰醋酸水溶液分离山银花特征成分效果较好，乙腈-0.08 %三乙胺水溶液分离防己特征成分较好，峰形好，出峰快。同时发现，流动相中酸碱比例的轻微变化对特征成分的分离影响不大。
本研究结果表明，绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、粉防己碱和防己诺林碱5种成分在不同批次清肝利胆口服液的高效液相色谱图中均可检测，表明清肝利胆口服液的制备工艺较为稳定。经相应的方法学考察，测定了清肝利胆口服液中的生物碱盐、有机酸和三萜皂苷类成分，各成分分离效果均符合现行药典要求，样品前处理简单，可为企业控制该产品质量和药品监督抽检等提供依据，也可为该品种质量标准的制定提供参考。
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