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蒲晗旭，张 露，李茂淋,3，陶 烽，王 静，罗 鹏*，王国泽*
（1.贵州医科大学公共卫生与健康学院，环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵阳 550025；
2.贵州省食品营养与健康工程研究中心，贵阳 550025；
3.成都大学食品与生物工程学院，四川成都 610106）
冬荪，又称白鬼笔（Phallus impudicus），属于鬼笔目（Phallales）、鬼笔科（Phllaceae）、鬼笔属（Phallus），属于珍稀食药用真菌[1]，在夏季和秋季主要生长于树林里的腐烂树叶堆中，具有独特的外观且达到成熟期时会散发臭味[2]。Li 等[3]从形态学与系统发育树证实了其是一个新种，并命名为“冬荪”。贵州大方冬荪，是贵州省毕节市大方县特产，2016 年11 月04 日，大方冬荪被批准为中国国家地理标志产品[4]。冬荪具有极高的药食两用价值[5]。在药用方面，冬荪子实体可入药，有祛风除湿和活血止痛的功效；
冬荪多糖具有保湿、增强免疫等作用[6-7]。而作为食品，冬荪味道鲜美、口感嫩滑，有着极高的营养价值。食用菌多糖作为一类分子结构复杂的糖类物质，由10 个以上的单糖通过糖苷键等连接构成，目前研究发现其对肥胖[8]、血脂异常和二型糖尿病[9]等多种慢性代谢疾病有一定的改善作用。食用菌多糖作为益生元，具有减少体内脂肪积累、降低体质量、保护肝脏的功能[10]。此外，大量研究发现食用菌多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、调节免疫等多种生物活性，如杏鲍菇多糖可促进免疫因子的分泌，进而加强宿主免疫[11]等。
目前多糖的提取方法很多，有水提醇沉、微波辅助提取、超声辅助提取、煎煮法、回流提取与膜分离技术等[12-13]。微波辅助提取选择性高、操作时间短、溶剂消耗量少，但设备泄漏的微波辐射会给人体造成慢性损伤。煎煮法简便易行，能煎出大部分有效成分。尤其适用有效成分能溶于水，对温、热均稳定的药材；
但对有效成分的选择性差，且杂质较多，精制较困难，样品容易霉变、腐败变质，不易保存。一些不耐热及挥发性成分在煎煮过程中易被破坏，挥发而损失。回流提取法消耗溶剂少，回流法由于连续加热，浸出液在蒸发锅中受热时间较长，故不适用于受热易破坏的样品成分浸出。膜分离技术有效成分损失极少，特别适用于热敏性物质，如抗生素等医药、果汁、酶、蛋白的分离与浓缩；
适应性强，处理规模可大可小，可以连续也可以间隙进行，工艺简单，操作方便，易于自动化；
缺点为不能将产品浓缩成干物质。水提醇沉法是目前较为常见的食用菌多糖提取方法，试验设备简单，操作容易，准确度高，成本低廉，一次性投入较小，缺点为耗时长，劳动强度大，提取效率低，提取过程中醇使用量大，但多糖是热敏性物质，长时间在高温下会影响其生物活性。近年来，超声技术提取植物活性成分的研究方法日益兴起[14-15]，该提取技术作为一种物理粉碎过程，借助超声波强烈的“空穴作用”，通过破碎植物细胞壁、提高细胞内容物穿透性，进而释放更多植物内部的有效成分，具有易操作、提取快捷、提取率高等特点[16]。超声的物理性质，可促使植物组织破裂或变形，使中药有效成分的提取更加充分，与传统工艺相比，提取率提高50%～500%。与传统工艺相比，超声强化提取一般能在24～40min内得到理想的提取率，比传统的中药提取法缩短2/3 以上，从而提高了原料的处理效率。超声波提取药液杂质少，有效成分容易分离纯化。基于此，本研究拟采用超声辅助热水浸提法优化冬荪多糖的提取工艺。
目前贵州省大方县冬荪得到了大量的推广种植，冬荪采摘过程中，仅采摘其菌柄以上部分，而大量冬荪菌托被直接遗留在田间地头，造成大量的资源损失，而且加重环境负担。已有研究表明冬荪菌托中多糖含量很高[17]，因此可将其作为提取多糖的良好来源。目前对冬荪多糖的成分研究多集中在多糖的组成、结构和分子量等方面，而研究对象多集中在其子实体（干品、鲜品、菌盖、菌托、菌柄）和菌丝体[18-20]。本文以冬荪菌托为研究对象，采用响应面法优化冬荪菌托多糖的提取工艺，以期为冬荪菌托的产业链开发，冬荪菌托多糖生物活性研究提供理论基础。基于此，本研究拟采用响应面法进一步优化冬荪菌托多糖的提取工艺。
1.1 材料与试剂
冬荪菌托购买于贵州省毕节市大方县，经反复清洗，用60 ℃电热恒温鼓风干燥机烘干至恒质量，粉碎后备用。
葡萄糖，天津市科密欧化学试剂有限公司；
正丁醇，纯度≥99.5%，天津市科密欧化学试剂有限公司；
苯酚，纯度≥99.0%，重庆川东化工（集团）有限公司；
三氯甲烷，纯度≥99.0%，重庆川东化工（集团）有限公司；
无水乙醇，纯度≥99.7%，重庆川东化工（集团）有限公司；
浓硫酸，纯度95.0%～98.0%等。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
400A 多功能打粉机，永市红太阳机电有限公司；
RE-52A 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；
DZ-3BCⅡ真空干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；
SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技有限公司；
multiskan 酶标仪，赛默飞世尔科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 冬荪菌托多糖的制备
选择新鲜冬荪菌托，洗净、冷冻烘干，用粉碎机粉碎，按照液料比27∶1（mL/g）加水溶解，535 W 超声32 min，热水浸提，3 500 r/min 离心10 min，去掉沉淀，浓缩上清液，最终使得浓缩后的多糖溶液40 mL 左右，采用Sevag法脱蛋白按照比例（试剂∶浓缩液）=1∶1 进行配比，试剂组成为正丁醇∶三氯甲烷=1∶4，加入试剂，快速搅拌10 min 左右，在通风橱里操作，再放到空气浴振荡器中震荡30 min，转速200 r/min，取出样品，分装到50 mL 离心管，4 000 r/min、15 min。离心结束后取出，去除中间蛋白质，将多糖溶液与有机试剂继续搅拌混匀，再次振荡30min，然后离心，去蛋白，重复3 次，直至中间无蛋白质层出现。加入95%乙醇，置于冰箱4 ℃沉淀过夜，用80 目的过滤筛过滤弃去乙醇溶液，将各样品放入真空干燥箱，关闭箱门用真空干燥箱烘干沉淀物，获得冬荪菌托多糖。
1.3.2 葡萄糖标准曲线绘制
本试验采用苯酚-硫酸法检测多糖的含量[21-23]。购买葡萄糖标准品，用真空干燥箱将其干燥至恒质量，精确称量200 mg，加入去离子水使其溶解，用100 mL 容量瓶定容，得到2.0 mg/mL 的葡萄糖标准溶液。使用2.0 mg/mL的葡萄糖标准溶液配制成浓度分别为0、20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖标准溶液，分别用移液枪吸取200μL，置于2 mL 连盖圆底离心管中，再各自加入200 μL 5%的苯酚溶液，快速摇匀，紧接着缓慢滴加700 μL 浓硫酸，快速摇匀，80 ℃水浴加热10 min；
冷水浴5 min 使之冷却至室温，在490 nm 波长处测量吸光度值，葡萄糖的吸光度值与浓度之间的回归方程为y=0.006 9x-0.003，R2=0.999 3，即葡萄糖标准品在0～100 μg/mL 浓度范围内呈良好的线性关系。
1.3.3 冬荪菌托多糖含量测定
按上述方法进行样品溶液多糖含量的测定，根据所测样品溶液的吸光度值得出冬荪菌托多糖的含量，按照公式（1）计算冬荪菌托多糖的提取得率。
式中，y为多糖提取得率，%；
c为溶液中多糖浓度，mg/mL；
V为多糖溶液体积，mL；
N为多糖溶液稀释倍数；
m为冬荪菌托干粉质量，g。
1.3.4 单因素试验
水浴温度分别设置为75、80、85、90、95 ℃，超声功率设置为350、400、450、500、550 W，超声时间设置为20、25、30、35、40 min，液料比设置为18∶1、23∶1、28∶1、33∶1、38∶1 mL/g，进行单因素试验。
1.3.5 响应面优化试验
基于单因素试验的结果，确定冬荪菌托多糖提取得率为响应值，设计四因素三水平的中心组合响应面试验，对冬荪菌托多糖提取方案进行优化（表1）。
表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface design
1.4 数据处理
采用Design-expert 8.0.6 软件分析试验数据。
2.1 单因素试验结果
2.1.1 水浴温度对冬荪菌托多糖提取得率的影响
固定超声功率550 W、超声时间为30 min、液料比为33∶1（mL/g），调整水浴温度进行冬荪菌托多糖提取试验。由图1 可知，随水浴温度升高，多糖提取得率先升高后降低，当水浴温度为90 ℃时，达最大值（6.321%）。有研究发现较高温度会破坏多糖结构，导致多糖发生降解[24]。因此，最佳水浴温度选择90 ℃。
图1 水浴温度对冬荪菌托多糖提取得率的影响Fig.1 Effects of extraction temperatures on the extraction rate of polysaccharide
2.1.2 超声功率对冬荪菌托多糖提取得率的影响
固定水浴温度为90 ℃、超声时间为30 min、液料比为33∶1（mL/g），调整超声功率进行冬荪菌托多糖提取试验。由图2 可知，随超声功率的逐渐增大，多糖提取得率先升高后降低，当超声功率达500 W 时，多糖提取得率达最大值，为6.997%。出现该现象的原因可能在于超声功率增大到一定程度后，体系空化作用过于强烈，分子快速聚积使局部产生高温，多糖分子因长时间受高温作用而失活，因此多糖提取得率反而减少[26]。故超声功率选择500 W。
图2 超声功率对冬荪菌托多糖提取得率的影响Fig.2 Effects of ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharide
2.1.3 超声时间对冬荪菌托多糖提取得率的影响
固定水浴温度为90 ℃、超声功率为500 W、液料比为33∶1（mL/g），改变超声时间进行冬荪菌托多糖提取试验。由图3 可知，随超声时间的延长，多糖提取得率先升高后降低，当超声时间为30 min 时达最大值（6.807%）。超声波促进多糖分子溶出的原理是通过物理作用破碎细胞壁，当超声时间延长后，因储蓄了超负荷的超声能量，多糖分子的化学键容易断开，多糖失活并析出，致使出现多糖提取得率减少的现象[25]。故确定超声时间为30 min。
图3 超声时间对冬荪菌托多糖提取得率的影响Fig.3 Effects of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharide
2.1.4 液料比对冬荪菌托多糖提取得率的影响
固定多糖提取条件为水浴温度90 ℃、超声功率500 W、超声时间30 min，改变液料比进行冬荪菌托多糖提取试验。由图4 可知，随液料比的增大，多糖提取得率先升高后降低，当液料比为28∶1 时达最大值（7.228%）。可能因溶剂增多后使超声波破碎细胞的阻力随之增大，导致细胞破碎程度降低[26]，且溶剂过多，大量杂质随之析出，多糖溶出空间被抢占，致使多糖提取得率反而下降。因此，液料比选择28∶1。
图4 液料比对冬荪菌托多糖提取得率的影响Fig.4 Effects of liquid-solid ratio on the extraction rate of polysaccharide
2.2 响应面法优化竹荪菌托多糖提取工艺
2.2.1 响应面试验设计方案及结果
如表2 所示，本试验的响应面试验结果利用Design-expert 8.0.6 软件进行回归分析，建立了如下响应面回归方程：冬荪菌托多糖提取得率Y=7.25+0.47A+0.60B+0.28C+0.24D-0.041AB+0.41AC+0.34AD+0.27BC-0.678D-0.25CD-0.84A2-0.59B2-0.83C2-0.53D2。
表2 响应面试验设计及结果Table 2 Arrangement and experimental results of response surface test
由表3 可知，此模型R2=0.951 5，模拟显著性P＜0.01，失拟项（0.091 9）＞0.01，表明该模型具有较好的稳定性，可用该模型对真实情况进行预测。本试验设置的4个单因素对多糖提取得率均有极显著影响，AC、BD 交互作用对冬荪菌托多糖提取得率的影响是极显著的，AD交互作用对多糖提取得率影响为显著，而AB、BC、CD 交互作用对菌托多糖提取率无显著影响。Design-expert 8.0.6 软件分析表明冬荪菌托多糖最优提取工艺为水浴温度91.6 ℃，超声功率535.43 W，超声时间31.97 min，液料比26.94∶1（mL/g），多糖提取得率预测最高理论值为7.568%。
表3 回归模型方差分析结果Table 3 Variance analysis results for regression model
2.2.2 因素交互作用分析
图5（见下页）反映各因素对响应值的影响。由图5a可知，当水浴温度升高及超声时间延长时，冬荪菌托多糖提取得率出现先增大后减小的情况，且等高线为椭圆形，表明两因素的交互作用显著。而对于多糖提取得率的影响程度来说，水浴温度发生变化导致的影响更为明显，超声时间对其影响程度相对较小，即冬荪菌托多糖提取得率受水浴温度的影响更大。由图5b 可知，多糖提取得率随水浴温度和液料比升高，出现先增后减的情况，但多糖提取得率在水浴温度方向的变化较液料比方向的变化更明显，也表示多糖提取得率受水浴温度的影响更突出。从图5c 可知，随着超声功率增大和超声时间延长，冬荪菌托多糖提取得率先提高后减小，但多糖提取得率在超声功率方向增加程度比在超声时间方向增加程度更明显，说明超声功率对多糖提取得率的影响比超声时间更大。图e、d、f 依次按此法进行分析。由响应面图分析可得出结论：超声功率对多糖提取得率影响最显著，其次是水浴温度，而超声时间、液料比影响较小。
图5 两因素交互作用对冬荪菌托多糖提取得率的响应面图Fig.5 Response surface diagram of the interaction of two factors on the extraction yield of polysaccharide from volva of P. impudicus
2.2.3 最佳工艺验证试验结果
为便于实际操作，调整最佳提取条件为水浴温度92 ℃、超声功率535 W、超声时间32 min、液料比27∶1（mL/g），经进一步验证试验，得出多糖提取得率为7.442%，与模拟预测值接近。因此利用响应面法优化冬荪菌托多糖的提取方法是较为可靠的。
有研究表明冬荪菌托的多糖含量是冬荪菌盖和菌柄的3 倍多，从冬荪菌托中提取多糖并将其开发为具有生物活性的健康食品不仅解决了冬荪菌托对环境的影响，还实现了冬荪的综合利用，延长了冬荪产业链。
本试验采用响应面分析方法，得出冬荪菌托多糖提取的最佳工艺条件为水浴温度92 ℃、超声功率535 W、超声时间32 min、液料比27∶1（mL/g），此工艺条件下所得冬荪菌托多糖提取得率为7.442%，与模型理论最大值相近。此工艺可为冬荪菌托多糖的开发利用提供理论基础和技术支撑。
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