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宋 曦，王 菲，王应强
（陇东学院农林科技学院，甘肃庆阳 745000）
庆阳位于甘肃省东部，是我国苹果优质产区之一，已形成规模化生产、销售模式，昼夜温差大，日照时间长，因此庆阳苹果各类营养素含量较高[1-4]。随着苹果种植业的发展，目前庆阳市已经形成了“龙头企业＋合作社＋农户”的生产模式，但苹果采后以简单贮藏为主，缺乏大型商业化冷库，影响苹果的贮藏期，产品损耗较大[5]。庆阳苹果销售以鲜果为主，非商品果主要加工成果汁，产品单一，且不同品种苹果加工果汁品质难以控制，酸度不够，导致其市场竞争力较弱，所以开发新的苹果加工产品，对提高果农种植收益，丰富苹果加工品非常重要[5-6]。
乳酸菌作为益生菌，目前在发酵果汁饮料的开发中应用较多，通过乳酸菌发酵可以提高果汁酸度，增加果汁中功能因子含量，提高果汁营养价值和商品价值[7-8]。直投式乳酸菌是一类不需要活化、增殖，是可以直接投入生产中使用的产品，具有安全性高、活菌数量多等优点，能够缩短发酵生产周期，同时产生益生因子，提高机体免疫力，调整肠道微生态等，直投式乳酸菌在发酵泡菜中应用较广，在发酵苹果汁中应用较少[9-12]。庆阳作为苹果产区，开发直投式乳酸菌发酵苹果汁产品，可以丰富苹果加工产品种类，增加果农收入，提高农产品的商业价值，为当地的经济社会发展做出贡献。本试验利用Design-Expert 软件进行了Box-Behnken 响应面试验设计，优选出最适的直投式乳酸菌发酵苹果汁饮料的工艺条件，为生产发酵型苹果汁提供一定的理论依据。
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
苹果汁，果汁浓度100%，经销商为镇江泛亚进出口贸易有限公司；
乳酸菌种YO-MIX883 LYO，法国丹尼克斯。
乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、水苏糖、棉籽糖、牛皮胶原蛋白（含量99%）、玉米低聚肽、大豆分离蛋白、乳清蛋白粉，均为食品级，山东齐鲁生物科技公司生产。
1.1.2 仪器与设备
电子天平，200706880，美国双杰兄弟有限公司；
立式全温振荡培养箱，ZQPL-200，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；
酸度计，PHS-25，上海越平科学仪器有限公司；
手持糖度计，OKW-15，山东恒安电子科技有限公司；
冷藏冷冻箱，BCD-206STPH，青岛海尔股份有限公司。
1.2 方法
将100 mL 苹果汁加入200 mL 经灭菌的玻璃酸奶瓶中，添加不同的无菌碳源、氮源，在超净工作台上接种直投式乳酸菌发酵剂后，放置于恒温培养箱中发酵，最终得到发酵苹果汁饮料。
1.3 单因素试验
1.3.1 果汁浓度对发酵苹果汁饮料的影响
将原苹果汁浓度设置成15%、25%、35%、45%、55%、65%的水溶液，接种0.3%直投式乳酸菌，37 ℃发酵24 h，测定pH 值，根据感官评分选出最适苹果果汁浓度。
1.3.2 碳源对发酵苹果汁的影响
将乳糖、葡萄糖、水苏糖、棉籽糖、蔗糖、结晶果糖按照10%的比例分别加入35%的苹果汁中，接种0.3%乳酸菌，37 ℃发酵24 h，考察不同碳源对发酵苹果汁品质的影响，测定果汁pH 值，根据感官评分筛选乳酸菌发酵的最适碳源。
1.3.3 氮源对发酵苹果汁的影响
将牛皮胶原蛋白、天然玉米低聚肽、大豆分离蛋白、乳清蛋白粉按照6%的比例分别加入浓度为35%的苹果汁中，添加10%的葡萄糖，接种0.3%的乳酸菌，37 ℃发酵24 h，测定果汁pH 值，根据感官评分筛选乳酸菌发酵最适氮源。
1.3.4 碳源添加量对发酵果汁的影响
将乳酸菌发酵最适碳源分别按照8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%添加到发酵果汁中，接种0.3%的乳酸菌，37 ℃发酵24 h，根据感官评价确定最适的碳源添加量。
1.3.5 氮源添加量对发酵果汁的影响
将乳酸菌发酵最适氮源分别按照5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%添加到发酵苹果汁中，接种0.3%乳酸菌，37 ℃发酵24 h，根据感官评价确定最适氮源添加量。
1.4 响应面优化工艺试验
根据单因素试验结果，利用Design-expert 8.0.6 分析软件进行Box-Behnken 响应面试验设计，以感官评价值（Y）为响应值，分别选取果汁浓度、碳源添加量、氮源添加量3 个因素，设计三因素三水平响应面试验，试验因素水平表见表1（见下页）。
表1 Box-Behnken 试验因素与水平设计Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design
1.5 测定指标与方法
1.5.1 还原糖含量测定
参照GB 5009.7—2016 测定食品中还原糖含量[14]。
1.5.2 果汁pH 值测定
1.5.3 感官评定
邀请8 名工作人员对乳酸菌发酵苹果汁进行感官评价，考察指标为组织形态、香味、滋味、色泽，满分100 分，具体评分标准如表2 所示[15]。
表2 发酵苹果汁感官评分标准Table 2 Sensory standards for apple juice
1.6 数据处理
用Origin 8.0 作图，采用Design-expert 8.0.6 软件对响应面试验数据统计分析。
2.1 单因素试验结果
2.1.1 果汁浓度对发酵苹果汁品质的影响
由表3 可知，随着苹果汁浓度升高，发酵苹果汁酸度也逐渐增大，当果汁浓度达到65%时，发酵苹果汁pH 值为4.1，主要原因是果汁中营养成分越多，乳酸菌的生长越快，产乳酸量越多，所以酸度越大，酸的强度与其果汁的含量有显著的关系[16]。
中国营养保健食品协会发布的数据显示，当前我国特殊食品（包括保健食品、婴幼儿配方乳粉、特殊医学用途配方食品以及婴幼儿辅食等）年产值约6000亿元，并保持持续增长态势。
表3 不同苹果汁浓度对发酵苹果汁感官评价的影响Table 3 Sensory evaluation of fermented juice with different juice concentration
感官评价结果显示，发酵苹果汁的质地、色泽和口感都会随果汁浓度的变化而变化。随着果汁浓度的增大，感官评价得分先增加后降低。当苹果汁浓度为15%、25%时，果汁含量低，发酵果汁虽然质地透亮，但色泽较淡，不具有典型的苹果香气。当果汁浓度为35%时，发酵苹果汁的感官评分最高，为80.25。当果汁浓度为45%、55%时，制得的产品有沁人心脾的苹果香味，但发酵风味不显著，且存在沉积物，口感略微酸涩，果汁浓度大提高了生产成本。因此，在保证口感俱佳的前提下，选择35%的苹果汁浓度进行后续试验。
2.1.2 碳源对发酵苹果汁品质的影响
碳源是微生物的6 大营养物质之一，乳酸菌可以通过糖发酵产生乳酸，但不同的糖利用程度不同。从表4 可以看出，与其他糖类相比，直投式乳酸菌在苹果汁中对碳源的利用率从大到小依次为葡萄糖、棉籽糖、乳糖、蔗糖、果糖、水苏糖，可以看出当碳源为葡萄糖时，发酵苹果汁的感官评分最高，其滋味和香味更容易被人接受。因此选用葡萄糖作为碳源。
表4 碳源对发酵苹果汁的影响Table 4 Effects of carbon source on fermented apple juice
2.1.3 氮源对发酵苹果汁品质的影响
添加不同氮源发酵苹果汁，结果表明添加乳清蛋白粉发酵苹果汁酸度最大，可以达到4.43，变化最为明显。在相同的发酵条件下，采用乳清蛋白粉进行发酵的苹果汁具有更好的香味和滋味，感官评价得分见表5。
表5 不同氮源对发酵苹果汁品质的影响Table 5 Effect of different nitrogen sources on the quality of fermented apple juice
乳酸菌可以通过将不同氮源分解形成低分子的寡肽以适应其自身的生长需求。结果表明，添加氮源有利于促进乳酸菌的生长和风味成分的产生，从而使产品感官质量更好[17]。乳清蛋白粉经过乳酸菌发酵后可产生大量的功能性多肽，具有抑制血管紧张转化酶活性、抗氧化等功能[18]。由表5 可知，添加乳清蛋白粉发酵的苹果汁感官评分最高，具有乳香味，更容易被人们接受。因此，氮源选择乳清蛋白粉。
2.1.4 碳源添加量对发酵果汁品质的影响
由表6 可知，随着葡萄糖添加量的增加，发酵苹果汁的感官评分先增大后减小，当添加量为12%时，发酵苹果汁感官评分最高，为82.63 分。微生物繁殖过程中，不同碳源对果汁的发酵风味有一定影响。感官评价结果表明乳酸菌发酵苹果汁中以葡萄糖为碳源，添加量低时果汁发酵风味较差，口感酸涩，添加量过高果汁过甜，酸度不够。因此，将葡萄糖添加量设置为12%。
表6 碳源添加量对发酵果汁品质影响Table 6 Effect of carbon source addition on the quality of fermented apple juice
2.1.5 氮源添加量对发酵果汁品质影响
乳清蛋白粉可作为食品营养强化剂，本身具有独特的牛乳香气，控制其添加量，可为发酵果汁提供新的风味。由表7 可以看出，随着乳清蛋白粉含量的增加，发酵苹果汁感官评得分逐渐降低。当乳清蛋白粉添加量少时，发酵香味较好，这是由于果汁中的氮源适宜，有利于乳酸菌繁殖，发酵产品品质较好。当乳清蛋白粉的含量增加时，发酵果汁色泽明显加深，果汁更加浓稠，同时乳清蛋白粉本身具有独有的风味，会影响果汁整体的风味，而乳清蛋白粉添加量低于5.0%时，果汁色泽较淡，酸度较低，整体风味不足，所以乳清蛋白粉添加量设置为5.0%。
表7 氮源添加量对发酵果汁品质影响Table 7 Effect of nitrogen source addition on the quality of fermented juice
2.2 响应面回归模型的建立与分析
2.2.1 响应面试验设计与结果
选取苹果汁浓度（A）、氮源添加量（B）、碳源添加量（C）三个因素，以感官评价得分为响应值，设计3 因素3水平响应面试验，结果见表8（见下页）。
表8 响应面Box-Behnken 试验设计及结果Table 8 Design and results of response surface Box-Behnken test
采用Design-Expert 8.0.6 软件对所得数据进行回归分析，感官评价得分（y）对自变量果汁浓度（A）、氮源添加量（B）、碳源添加量（C）建立回归模型，得到的方程为y=80.12+2.40A-0.29B+0.89C-0.020AB-0.15AC-0.006BC+0.038A2-1.16B2-0.87C2。
回归模型方程方差分析结果见表9。
由表9 可知，响应面试验设计拟合模型呈极显著水平（P＜0.01），且失拟项不显著（P＞0.05），说明回归方程预测响应值有较好的拟合度，试验设计准确可靠，可以用此模型分析和预测乳酸菌发酵苹果汁的工艺。在响应值为感官评价结果的模型中，A（苹果汁浓度）、B（氮源添加量）、C（碳源添加量）及B2、C2的交互作用对苹果汁的感官评价有显著的影响，AB、AC、BC 和A2对其影响不显著。因此，影响苹果发酵汁感官质量的主要因素依次是苹果汁浓度、碳源添加量、氮源添加量。
表9 响应面试验方差分析表Table 9 The results of variance analysis
2.2.2 因素交互作用分析
由图1 响应曲面图可以直观地看出，苹果汁浓度和氮源添加量有较为明显的坡度，且等高线图呈椭圆形，交互作用显著，果汁浓度和碳源添加量之间交互作用较为显著，氮源添加量和碳源添加量对果汁口感影响显著。
图1 各因素交互作用对感官评价的响应面图Fig.1 Response surface diagram of the interaction of factors on sensory evaluation
2.2.3 验证试验
响应面试验结果得出：发酵苹果汁最佳工艺条件为乳酸菌接种量0.3%、果汁浓度35%、氮源5.18%、碳源12.42%、发酵温度37 ℃、发酵时间24 h，感官评价可达到86.32。为便于试验操作，将最佳工艺参数调整为接种量0.3%、果汁浓度35%、氮源5%、碳源12.5%、发酵温度37℃、发酵时间24 h，经过试验感官评价后得到86.96。通过与验证试验结果比较，说明最终试验结果与该回归模型拟合度良好。因此，采用响应面分析法优化得到的乳酸菌发酵苹果汁条件具有较高的精准度和可靠性。
本研究主要是以苹果汁为原料，对发酵苹果汁的条件进行优化，单因素试验得出：当果汁浓度为35%时，发酵果汁口感色泽俱佳；
在果汁中添加5%葡萄糖，此时苹果汁色泽呈现原果汁光亮，有原苹果汁香气，口感酸甜可口；
添加12%乳清蛋白粉，果汁有乳清蛋白粉独特的风味，使得苹果汁口感多元化。响应面试验中根据方差分析可以得出对乳酸菌发酵苹果汁的影响因素主次为果汁浓度、碳源添加量、氮源添加量。通过Box-Behnken优化试验，得出直投式乳酸菌发酵苹果汁的最佳工艺条件是乳酸菌接种量为0.3%、果汁浓度35%、5%乳清蛋白粉、12.5%葡萄糖，37 ℃发酵24 h，经过验证试验感官评价后得到86.96 分。
