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管庆霞，聂泽卉，董 诗，温美欣，赵梦瑶，林泽榆，王彦伟*
（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；
2.黑龙江瀚泊尔科技发展有限公司，黑龙江 哈尔滨 150040）
血虚（blood deficiency，BD）是女性常见疾病，通常是由劳累过度，缺乏营养，失血过多等原因所致[1]。据统计，女性血虚发病率高达64 %，并呈逐年递增态势，对女性身心健康造成极大影响。目前有多种缓解血虚的方法，中药治疗法仍占据主要地位，临床应用较广泛的是中药复方制剂[2]。
复方鹿茸超微混悬酒所用处方是由依据中医临床经验而来，方中11味中药：鹿茸擅在其益精填髓，精旺以化气生血；
川芎通行血海以调经[3]；
当归营养血脉以荣经[4]；
白芍敛阴以益肾肝；
黄芪补气以益卫阳；
熟地补血以滋冲任；
人参扶元以通血脉；
肉桂温营血以散外邪；
柏子仁养血以安神；
丹皮凉血热以散滞[5]；
乌梅养肝以补血，共同配伍，共奏补血调经之效。本研究将鹿茸制为超微粉，提取其他药味的有效成分，以酒为溶媒，将超微粉混悬剂与药酒两者的优势相结合，并对其处方工艺、药效等进行研究评价，以期实现用药少、药效强、方便调配、便于服用、药效稳定、增强补血作用的效果。
YJ-L10气流粉碎机（潍坊精华粉体工程设备公司），SIGMA500扫描电子显微镜（北京欧波同光学），Waters e2695-2698高效液相色谱仪系统（美国Waters），UV-4802双束紫外可见分光光度计（尤尼柯仪器），SB-5200D超声波清洗机（宁波新芝），AB265-S梅特勒电子天平（瑞士梅特勒托利多），XS-500i全自动血液分析仪（希森美康）；
鹿茸（市购），中药饮片（黑龙江汇仁药材），环磷酰胺（批号：A22A7X13656，上海源叶），乙酰苯肼（批号：SJ0121RA14，上海源叶），芍药苷对照品、阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院）；
昆明种小鼠，雌性，体重20±2 g，清洁级动物（黑龙江中医药大学GLP实验中心）；
复方阿胶浆（山东阿胶）。
2.1 芍药苷与阿魏酸分析方法的建立
2.1.1 色谱条件 芍药苷色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
检测波长：230 nm；
流速：1.0 ml/min；
进样量：10 μl；
柱温：30 ℃。阿魏酸色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
检测波长：321 nm；
流速：1.0 ml/min；
进样量：10 μl；
柱温：35 ℃。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称定芍药苷对照品3.56 mg，置入10 ml棕色量瓶，加甲醇使其溶解并稀释至刻度，得芍药苷储备液。精密称定阿魏酸对照品2.39 mg，置入25 ml棕色量瓶，加70 %甲醇使其溶解并稀释至刻度，得到阿魏酸储备液。
2.1.3 供试品溶液的制备 将不含鹿茸的其他药味按照处方比例粉碎混合，称取约2 g，加入20倍60 %的乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，过滤，定容至25 ml，减压浓缩，冷冻干燥，得到固体粉末，取一定量用甲醇或者70 %甲醇复溶，得到供试品溶液[6]。
2.1.4 空白对照溶液的制备 以70 %甲醇作为空白对照溶液。
2.1.5 专属性考察 分别取芍药苷与阿魏酸的对照品溶液、供试品溶液、空白溶液适量，按照色谱条件进样，记录色谱，见图1。结果表明：在检测条件下，溶剂对芍药苷与阿魏酸的含量测定均无干扰，该方法的专属性良好。
图1 高效液相色谱图
2.1.6 方法学考察 精密吸取2.1.2项下芍药苷储备液，用甲醇逐级稀释至浓度分别为356.00，178.00，89.00，44.50，22.25 μg/ml，以对照品的浓度（X，μg/ml）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线为Y=14 512X+94 239（R2=0.9988）。结果表明，芍药苷在22.25～356.00 μg/ml范围内线性关系良好；
精密吸取2.1.2项下阿魏酸储备液，用70 %甲醇逐级稀释至浓度分别为15.30，7.65，3.82，1.91，0.96，0.24 μg/ml，以对照品的浓度（X，μg/ml）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线为Y=57 911X+6995.4（R2=0.9997），结果表明，阿魏酸浓度在0.24～15.30 μg/ml范围内线性关系良好。精密吸取芍药苷储备液和阿魏酸储备液，按照2.1.1项下色谱条件重复进样6次，测得峰面积RSD小于2 %，表明精密度良好。取2.1.3项下供试品溶液，在24 h内按2.1.1项下色谱条件测定峰面积RSD小于2 %，表明供试品溶液溶液在24 h内稳定。芍药苷加样回收率回收率范围99.35 %～102.35 %，RSD小于2 %，阿魏酸加样回收率范围97.47 %～102.38 %，RSD小于2 %，满足分析要求。
2.2 鹿茸药液的制备研究
将鹿茸净化、切片、冷冻干燥后用气流粉碎机超微粉碎。精密称量20.0 mg鹿茸超微粉，加入50 ml基酒，震荡摇匀，配制为鹿茸药液，为类乳白色混悬液。
2.3 不含鹿茸的药液制备研究
2.3.1 提取方法考察 以芍药苷和阿魏酸的总含量与出膏率为指标考察不同提取方法对不含鹿茸的中药提取效果的影响。取不含鹿茸的其他药味粉2 g，加10倍量50 %乙醇，分别用超声法、回流法[7]、煎煮法提取2次，每次30 min，合并提取液过滤，定容至25 ml，按2.1.1项色谱条件进样，计算含量，结果见表1。提取液经减压浓缩，冷冻干燥后称重计算出膏率。综合考虑，以回流法作为芍药苷与阿魏酸的提取方法。
表1 提取方法的考察（n=6）
2.3.2 单因素考察
2.3.2.1 乙醇浓度考察 设定乙醇浓度为50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，95 %6个水平进行考察。结果见图2，70 %乙醇时出膏率最多。
图2 乙醇浓度对总含量及出膏率的影响
2.3.2.2 液料比考察 设定液料比分别为8，10，12，15，20 g/ml 5个水平进行考察。结果见图3，液料比大于15倍量后，总量及出膏率均逐渐降低。
图3 料液比对总含量及出膏率的影响
2.3.2.3 提取时间的考察 设定提取时间分别为0.5，1，1.5，2 h 4个水平进行考察。结果见表4，提取时间在1.5 h前，芍药苷与阿魏酸总量逐渐增大，1.5 h后成分基本保持不变；
出膏率在提取时间1.5 h前同样逐步增大，1.5 h后有小幅波动。
图4 提取时间对总含量及出膏率的影响
2.3.2.4 提取次数的考察 设定提取次数分别为1，2，3，4次4个水平进行考察。结果见图5，出膏率在提取3次前逐步增大，3次后基本不变。
图5 提取次数对总含量及出膏率的影响
2.3.3 正交试验 选择乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取时间（C）、提取次数（D） 4个因素，每个因素选取3个水平，采用L9（34）表设计正交试验。综合评分=（含量/含量最大值）×50+（浸膏得率/浸膏得率最大值）×50。对综合评分进行直观分析和方差分析，结果见表2和表3。
表2 正交实验安排及结果
由表2可见，影响有效成分综合评分的因素主次顺序为B＞D＞A＞C，即液料比＞提取次数＞乙醇浓度＞提取时间。得到提取最佳条件为A2B3C3D3，即乙醇浓度60 %、液料比20倍、回流时间2 h、提取3次。
由表3可见，表明B、D即液料比与提取次数两个因素对有效成分的含量和出膏率具有显著性（P＜0.05）影响。C提取时间对其无显著影响，考虑到节省时间，选择最佳工艺为A2B3C1D3，即乙醇浓度60 %、液料比20倍量、回流时间1 h、3次。
表3 方差分析表
2.3.4 验证试验 按照上述优选的最佳工艺提取（n=3），测定芍药苷与阿魏酸总量与出膏率。结果见表4。由表4可见，单因素考察法和正交试验法优选得到的最佳提取工艺有重复性和稳定性。有效成分含量到较高，且能获得较多的浸膏，工艺可行。
表4 验证试验结果
2.3.5 干燥 按最佳工艺制得提取液，置旋转蒸发中进行真空减压浓缩，将浓缩液冷冻干燥，密封保存，即得冻干粉。以冻干时间为横坐标，冻干温度为纵坐标，绘制冻干曲线，见图6。
图6 冻干曲线
2.3.6 不含鹿茸的药液配制 称取0.60 g冻干粉，分散于50 ml基酒中，震荡均匀，澄清，调味，即得不含鹿茸药液，本品为深红棕色药液，酒气醇香。
2.4 复方鹿茸超微混悬酒的配制
取鹿茸药液50 ml，不含鹿茸药液50 ml，震荡混合均匀，得100 ml复方鹿茸超微混悬酒，本品为红棕色混悬液。
2.5 复方鹿茸超微混悬酒的补血作用研究
2.5.1 动物分组及给药 取清洁级雌性小鼠48只，体重20±2 g，随机分为6组，每组8只，即正常组、模型组、阳性对照组、低、中、高剂量组。低、中、高剂量组灌胃给药剂量分别为0.42，0.84和1.68 mg/(kg·d)，阳性对照组灌胃给药剂量10 ml/(kg·d)，正常组及模型组小鼠给予等体积生理盐水。调节酒精度15 %，每日灌胃1次，连续30 d。模型组、阳性对照组与给药组小鼠分别于给药的第4，10，20天皮下注射乙酰苯肼20，40，20 mg/kg，第10天起，每日腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg，连续4天制备血虚模型[8]。正常组小鼠同时注射等量生理盐水。小鼠造模同时灌胃给予受试药物。观察每组小鼠行为体征并称重。
2.5.2 统计学分析 采用SPSS17.0软件进行统计学分析，数据均值±标准差（±s），两组间差异比较用t检验，多组间采用单因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.5.3 对小鼠体重的影响 比较小鼠最开始体重与末次给药后体重的变化，不同剂量对小鼠体重的影响，见表5。
表5 复方鹿茸超微混悬酒对小鼠体重的影响（±s，n=8）
表5 复方鹿茸超微混悬酒对小鼠体重的影响（±s，n=8）
注：#P＜0.05，##P＜0.01 vs正常组；
*P＜0.05，**P＜0.01 vs模型组
组别 给药后体重增加值/g正常组 10.63±1.92模型组 5.25±0.70##阳性对照组 9.75±0.89**低剂量组 6.38±0.92*中剂量组 7.50±1.41**高剂量组 9.88±1.73**
2.5.4 对小鼠游泳时间的影响 各组小鼠均于末次给药0.5 h后，置游泳箱中，水深不少于30 cm，水温25±1.0 ℃，记录小鼠自游泳开始至力竭的时间（小鼠头部沉入水中，经10 s仍不能返回水面视为力竭）。结果见表6。
表6 复方鹿茸超微混悬酒对小鼠游泳时间的影响（±s，n=8）
表6 复方鹿茸超微混悬酒对小鼠游泳时间的影响（±s，n=8）
组别 游泳时间/min正常组 118.35±4.26模型组 64.37±2.22##阳性对照组 109.42±1.38**低剂量组 78.05±2.19中剂量组 96.35±3.43*高剂量组 107.13±5.06**
2.5.5 对小鼠外周血常规的影响 小鼠眼底静脉丛取血，采用XS-500i全自动血液分析仪检测血常规，主要包括外周血象中红细胞RBC（1012/L），血红蛋白HGB（g/L)，红细胞压积HCT（L/L），血小板PLT（109/L），白细胞WBC（109/L）单核细胞百分比MONO（%）共6项指标，见图7。
图7 复方鹿茸超微混悬酒对小鼠外周血象的影响
2.5.6 对小鼠免疫器官的影响 小鼠脱颈椎处死，剥取胸腺、脾脏和肝脏，剔除旁边的组织和筋膜后称湿重。按公式计算胸腺指数（thymus index，TI）、脾脏指数（spleen index，SI）和肝脏指数（liver index，LI），计算公式分别如下：TI=胸腺重（mg）/鼠重（g），SI=脾重（mg）/鼠重（g），LI=肝重（mg）/鼠重（g），不同剂量对小鼠免疫器官的影响见图8。
图8 复方鹿茸超微混悬酒对小鼠免疫器官的影响
综上，高剂量对小鼠的胸腺重量与TI、脾脏重量与SI、肝脏重量与LI均有显著性改善作用，中剂量对小鼠的胸腺重量、脾脏重量与SI、肝脏重量与LI有显著性改善作用，而低剂量只对小鼠的脾脏重量与SI、LI有显著性改善作用。综合考虑，初步暂定中高剂量对小鼠具有补血作用。
2.5.7 基于多指标综合指数法的补血效应 依据多指标综合指数法，首先对外周血常规、脏器和其他等多个指标进行归一化处理即标化，当模型组相应指标数值（value）与正常组相比升高时，V标化=（V模型-V给药）/V模型；
当模型组相应指标数值与正常组相比降低时，V标化=（V给药-V模型）/V模型。然后依据前期查阅文献并综合专家意见后给出的权重系数对各效应指标进行效应整合，指标WBC、RBC、HGB取权重为2，HCT、PLT、MONO%、TI、SI、LI、体重（M鼠）、游泳时间（T游泳）、胸腺重量（M胸腺）、脾脏重量（M脾脏）、肝脏重量（M肝脏）取权重为1。各指标数据的标化值乘以各自权重系数后的加和值即为该药物对于小鼠补血作用的总效应值（total effect，TE）。综合上述多个指标，对复方鹿茸超微混悬酒的总补血效应进行整合，结果见表7。
由表7可见，经过多指标综合指数法的处理，复方鹿茸超微混悬酒高中低剂量总补血效应顺序为：高剂量＞中剂量＞低剂量，高剂量补血效应最好。
表7 复方鹿茸超微混悬酒的总补血效应
本实验采用气流式粉碎机对鹿茸进行超微粉碎得到鹿茸超微粉，与基酒配制为鹿茸药液；
通过单因素考察法和正交试验法优化提取工艺配制为不含鹿茸的药液；
二者混合得到复方鹿茸超微混悬酒。在前期预实验中考察真空减压干燥法与冷冻干燥法对不含鹿茸的浓缩液干燥效果时发现，真空减压法干燥时间较长，且干燥效果不好，故本研究选用冷冻干燥法干燥浓缩液。考虑到方中还有多糖类化合物、贵细药材人参活性成分等补益功能成分，可作为下一步深入研究内容。
近年，血虚动物模型制备方法有失血法、环磷酰胺化学损伤法、乙酰苯肼溶血法、免疫介导法、60Co辐照法及复合法等[9]。因乙酰苯肼、环磷酰胺操作简便易于控制，本研究选用联合此两种方法。环磷酰胺可损害机体的免疫器官[10]，同时使骨髓造血干祖细胞的集落生成能力降低，导致骨髓造血障碍[11]，因此可制备出血虚模型。乙酰苯肼是一种对RBC有氧化性损伤作用的强氧化剂，这种损伤可使RBC崩解出现溶血性贫血，RBC和HGB数量明显降低，WBC数量升高，脾脏显著肿大呈深褐色。乙酰苯肼与环磷酰胺联合应用可从双重环节上造成动物血虚，其表现为各类细胞数量整体下降和免疫器官损伤而萎缩；
利用此种方法建立血虚模型，动物存活率高，血虚状态持续时间长[12]。乙酰苯肼可导致溶血性血虚证，使WBC升高，环磷酰胺可引起骨髓抑制性血虚证，使WBC降低[13]，同时，乙酰苯肼引起的溶血性血虚动物表现为胸腺指数降低，肝脏和脾脏指数升高，环磷酰胺引起的骨髓抑制性血虚动物表现为胸腺指数降低，肝脏和脾脏指数降低，在实验中血虚模型小鼠表现WBC指数增高，肝脏和脾脏指数升高，可知乙酰苯肼所致血虚占主导作用，与外周血中血虚主导作用一致。
本课题应用现代超微粉碎技术，将鹿茸制为超微粉以酒为媒介与复方提取物相结合配制为混悬剂，以期达到用量少、利用度高[14]、副作用小、改善女性血虚体质、减轻痛苦的目的。目前，超微粉碎技术仅局限于单味中药，中药复方及其体外制剂的超微粉碎的研究才刚开始，但是超微粉碎后的中药复方成分之间发生的匀化作用和理化性质的变化机制十分复杂，将可能成为未来中药复方超微粉碎化重点研究的方向。
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