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龙远雄, 徐寅, 邓桂明
(湖南中医药大学第一附属医院,湖南省长沙市 410007)
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种最常见的鳞状上皮细胞癌,其病因与EB病毒(epstein-barr virus，EBV)感染、遗传、环境因素密切相关，放化疗是目前治疗鼻咽癌的有效方法,但晚期高分化鼻咽癌患者对放疗灵敏度较差,预后效果不佳,常规化疗药物不良反应大、易产生耐药性,因此急需寻求安全高效的治疗方法来解决鼻咽癌治疗的瓶颈[1]。中医药治疗恶性肿瘤,在改善症状,提高生活质量等方面具有独特优势,白花蛇舌草具有清热解毒、消痛散结等功效,研究显示白花蛇舌草具有抗炎、抗肿瘤等作用[2]。本研究基于网络药理学研究其作用于鼻咽癌的有效成分、核心靶点与关键通路,揭示白花蛇舌草治疗鼻咽癌的药理作用,以其为后续研究提供参考依据。
1.1 白花蛇舌草有效化合物及作用靶点查询
TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索白花蛇舌草的化合物,以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug like，DL)≥0.18为筛选条件,提取白花蛇舌草主要活性化合物,通过化合物编号检索其作用靶标,并通过Uniport数据库(https://www.uniprot.org/)检索各靶点的基因名。
1.2 鼻咽癌相关靶点预测
基于GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)以“nasopharyngeal carcinoma”为关键词检索鼻咽癌相关靶基因,并与白花蛇舌草活性化合物靶点取交集,得到治疗鼻咽癌的相关作用靶点。
1.3 “化合物-靶点”网络构建与分析
将白花蛇舌草活性化合物及作用于鼻咽癌的相关靶点导入Cytoscape3.7.1软件中,构建白花蛇舌草活性化合物-鼻咽癌靶点网络图，利用“Network Analyzer”功能网络进行分析,根据化合物与靶点连接情况筛选关键化合物。
1.4 蛋白互作网络构建及核心靶点筛选
将交集靶点导入STING数据库(https://cn.string-db.org/),构建交集靶点蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络。借助Cytoscape3.7.1软件对网络进行拓扑分析,选取自由度(Degree)、介数、中心度均大于平均值的靶点为核心靶点。
1.5 GO功能富集分析与KEGG通路分析
将交集靶点导入DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp),进行GO功能富集和KEGG通路分析,对富集分析结果采用微生信平台和Cytoscape3.7.1软件进行可视化处理，分析核心靶基因功能和白花蛇舌草治疗鼻咽癌的主要作用通路。
1.6 分子对接
将关键化合物(配体)作用于核心靶点(受体)进行分子对接。从TCMSP数据库以及PDB数据库(https://www.rcsb.org/)中下载关键化合物分子与核心靶点的分子结构,并分别保存为mol2与pdb格式文件,将两者导入AutoDock1.1.2软件进行加工,输出pdbqt格式文件后进行对接,若配体与受体可自发结合,则结合能<0 kcal/mol,若结合能<-5 kcal/mol表示具有较好的结合活性,若结合能<-7 kcal/mol表示具有强烈的结合活性；
结合能绝对值越大,表示结合活性越强[3]。
2.1 白花蛇舌草有效化合物及作用靶点
白花蛇舌草有效化合物7个,获取各化合物靶点237个,其中MOL001646化合物找不到靶点,故实际有效化合物为6个(表1),对应去重后靶点数为123个,再通过Uniprot获取各靶点基因名。
表1 白花蛇舌草有效化合物基本信息表
2.2 鼻咽癌疾病靶点
检索到鼻咽癌相关靶点数2 143个,排序提取相关性得分≥5的靶点共908个纳入本研究。
2.3 化合物-靶点网络构建与分析结果
将白花蛇舌草123个靶点,与鼻咽癌908个靶点基因比对,获取交集靶点49个,可能是白花蛇舌草与治疗鼻咽癌相关靶点。Cytoscape3.7.1软件对6个活性化合物和49个靶点构建白花蛇舌草活性化合物-鼻咽癌靶点互作网络,Network Analyzer功能分析结果为网络中55个节点(化合物节点6个,靶基因节点49个)和80条边(图1)。提取Degree≥10的化合物作为关键化合物共4个,依次为槲皮素44度、β-谷甾醇12度、2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌11度、豆甾醇10度。
图1 白花蛇舌草活性化合物-鼻咽癌靶点网络图△为化合物节点,○为靶基因节点。
2.4 PPI网络构建及核心靶点筛选结果
STRING数据库构建交集靶点PPI网络(图2)。拓扑分析结果显示,自由度、介数、中心度数均超过平均值的靶点有12个,可能是白花蛇舌草治疗鼻咽癌的核心靶点(表2)。
表2 白花蛇舌草治疗鼻咽癌的12个核心靶点
图2 交集靶点蛋白互作网络图
2.5 GO功能与KEGG通路分析结果
结果显示49个交集靶点基因共影响163个生物学过程。其中生物进程(biological process，BP)122个,分子功能(molecular function，MF)过程23个,细胞组分(cell component，CC)18个。白花蛇舌草治疗鼻咽癌主要影响的BP富集于RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、转录正调控、DNA模板等；
影响的MF富集于蛋白质结合、酶结合等；
影响的CC富集于细胞核、细胞质等(图3)。
图3 GO功能富集结果
KEGG显示，49个交集基因得到通路共63条(P<0.01)。选择富集显著性(P.Value)排名前15的进行分析,并Cytoscape3.7.1构建白花蛇舌草活性成分-靶点-通路可视化网络图见图4。
图4 白花蛇舌草活性化合物-靶点-通路网络图
2.6 分子对接结果
将白花蛇舌草中关键化合物与Degree值排名前5核心靶点进行分子对接,结合能均<0 kcal/mol(表3)，表示白花蛇舌草中关键化合物与核心靶点可自发结合。
表3 白花蛇舌草关键化合物-核心靶点分子对接 单位：kcal/mol
鼻咽癌病因为外感六淫、内伤七情等,主要病机为正气不足、毒热内蕴、痰瘀互结,病理产物为火毒、瘀血、痰凝,临床治疗强调清热解毒[4]。中药白花蛇舌草可清热解毒,具有抗炎、抗肿瘤等作用,对鼻咽癌治疗具有较好的效果。
本研究结果显示，白花蛇舌草可能发挥鼻咽癌治疗作用的关键成分有槲皮素、β-谷甾醇、2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌、豆甾醇。槲皮素属于黄酮类化合物，能通过调节抑癌基因表达、阻断细胞周期、诱导细胞凋亡等发挥抗癌作用[5]。β-谷甾醇与豆甾醇均为甾醇类化合物，可通过阻滞细胞周期而抑制肿瘤细胞的增殖，能促使其发生典型的凋亡变化，诱导癌细胞凋亡并抑制其转移[6]。2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌为蒽醌类化合物，能够通过激活细胞表面诱导Fas、死亡受体4和肿瘤坏死因子凋亡，促进胱天蛋白酶8的活化诱导凋亡[7]。
PPI网络与拓扑分析筛选出12个核心靶点，最重要靶点TP53 Degree值最大。TP53抑瘤基因在DNA损伤和癌基因等应激条件下激活，阻滞细胞周期、抑制细胞增殖、诱导细胞分化、启动细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成，阻止肿瘤的发生发展[8]。VEGFA为本研究的关键靶点之二，能特异性刺激肿瘤血管内皮细胞增殖与血管生成，与VEGFR1结合可促进内皮细胞分裂和增殖，诱导癌细胞生长和转移[9]。JUN家族中的成员c-jun基因作为转录因子，可参与细胞的侵袭、迁移和转移,促进鼻咽癌的发展和放射抗性[10]。TNF细胞因子对肿瘤具有双向调控作用，既是抗癌活性最强细胞因子之一，亦是高水平下明显促进肿瘤进展以及转移相关基因之一[11]。研究发现，肿瘤坏死因子-α可通过激活ERK1/2信号通路，影响鼻咽癌细胞的侵袭和迁移能力[12]。IL-6可通过与自身靶细胞的IL-6受体结合调节肿瘤发生发展[13]。本研究分子对接结果显示，两者结合活性较好，其中槲皮素与靶点VEGFA、JUN、IL-6，β-谷甾醇与靶点TP53、TNF，2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌与靶点TNF，豆甾醇与靶点TP53、TNF、IL-6结合能均<-7.0 kcal/mol，说明上述靶点蛋白和关键化合物具有强烈的结合活性，在白花蛇舌草治疗鼻咽癌中可能发挥重要作用。
GO功能富集结果显示白花蛇舌草作用于鼻咽癌的靶点影响163个生物学过程，包括基因正向调控、蛋白表达、细胞核、细胞质等，这些生物过程可能在鼻咽癌的发展转归中体现重要作用。KEGG结果显示白花蛇舌草活性化合物可能作用癌症信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路而发挥作用。在HIF-1通路中，肿瘤在其发展过程中均会造成局部的乏氧微环境，进而激活HIF-1，特别是HIF-1α的表达明显增加，能促进肿瘤的迅速生长及侵袭[14]。PI3K-Akt信号通路参与细胞增殖、分化、迁移、凋亡和血管生成等过程，亦有研究表明此通路与鼻咽癌的发生及预后有密切联系[15]。
综上，白花蛇舌草可能通过关键化合物槲皮素、β-谷甾醇、2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌，豆甾醇作用于TP53、VEGFA、JUN、TNF、IL-6等关键靶点，影响相关生物学过程与关键通路干预鼻咽癌的发生发展。本研究初步分析了白花蛇舌草治疗鼻咽癌可能的作用机制，为后续研究提供了参考依据。
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