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李明显，周娜，郑细闰，杜晓华，李晓，郑广娟，何青莲*,汤丽鹏
1.广东省中医院，广州中医药大学第二临床医学院病理科，广州 510120；
2.广东省中医院，广州中医药大学第二临床医学院中药药理实验室，广州 510120
含小病灶的甲状腺组织冰冻切片结果的时效性和准确性不但取决于病理医生的取材经验和诊断水平[1]，而且离不开技术员的默契配合与熟练技巧[2]。为了保证同一小病灶在冰冻切片与冰余组织的石蜡切片上的吻合率，通常会在包埋盒上进行标记，但是传统方法的标记效果并不理想，仍然存在一定的漏诊。冰冻切片过程中有时也会出现其他差错，比如标签纸脱落或被割破，同一组织第二次切片时工作效率低。为了解决上述工作中的问题，改进方法从标签纸的选择到使用不断进行优化改进，使其能够高效地辅助完成与冰冻切片相关的各项操作，提高冰冻切片与石蜡切片病理诊断的吻合率，现介绍如下。
1.1 材料
收集2020 年6～10 月广东省中医院40 例包含小病灶的甲状腺组织进行冰冻切片，病灶直径范围0.2～0.5 cm，通过区组随机化平均分成对照组和改进组。对照组与改进组均由同一位病理技师分别应用传统方法与改进方法进行与冰冻切片相关的各项操作。主要设备耗材：冰冻切片及配件（Thermo，NX70），自动脱水机（Thermo，ES），石蜡包埋机（Thermo，HISTOCENTRE 3），石蜡切片机（Leica，RM2245），自动染色机（Leica，ST5020），修蜡仪（国产，HD-380），白色标签纸（自制），红色标签纸（衍纸）。
1.2 传统方法
待医生将组织放置在已经准备好的样本头上后，在白色标签纸上记录该组织的病理编号并将其粘贴在组织或样本头边缘，然后在组织表面滴加适量冷冻剂，待组织充分凝固后将该样本头安装在冰冻机的机头上进行切片、染色（图1A），记录从样本头准备至切片完成的消耗时间。将冰余组织连同白色标签纸放入包埋盒内，用铅笔在该包埋盒侧边涂黑进行标记，待冰余组织充分固定后依次脱水、透明、浸蜡、包埋、修蜡、切片、染色（图1B，图1C），观察包埋盒侧边的标记在修蜡过程中的变化，并比较冰冻切片与石蜡切片中小病灶的吻合率。
1.3 改进方法
待医生将组织放置在已经准备好的样本头上后，在红色标签纸上记录该组织的病理编号，将编号起始端蘸取少许该样本头上尚未凝固的冷冻剂，将该端贴于样本头的边缘时使其几何中心的长轴指向样本头的中心，并使组织上小病灶的中央区域位于样本头中心与标签纸之间，然后在组织表面滴加适量冷冻剂，同时在标签纸该端约0.5 cm 的部分用适量冷冻剂覆盖。待组织充分凝固后将该样本头安装在冰冻机的机头上并使标签纸位于12 点钟方向，依次进行切片、染色（图1D），记录从样本头准备至切片完成的消耗时间。将冰余组织连同红色标签纸放入包埋盒内充分固定后依次脱水、透明、浸蜡、包埋、修蜡、切片、染色（图1E，图1F），观察包埋盒内的红色标签纸在修蜡过程中的变化，并比较冰冻切片与石蜡切片中小病灶的吻合率。
图1 传统方法与改进方法在包含小病灶的甲状腺组织冰冻切片、石蜡包埋及修蜡过程中的效果比较1A:传统方法在冰冻切片过程中的应用 1B:传统方法在石蜡包埋过程中的标记效果 1C:传统方法的标记修蜡后的变化 1D:改进方法在冰冻切片过程中的应用1E:改进方法在石蜡包埋过程中的标记效果1F:改进方法的标记修蜡后的变化Fig.1 Comparison of the effect of traditional method and improved method in frozen section,paraffin embedding and paraffin repair of thyroid tissue with small lesions1A: application of traditional method in frozen section; 1B: marking effect of traditional method in paraffin embedding; 1C:changes of traditional method after waxing; 1D: application of improved method in frozen section; 1E: marking effect of improved method in paraffin embedding; 1F: changes of improved method after waxing
1.4 统计学方法
应用SPSS22.0 软件进行统计分析，两组间冰冻切片耗时比较采用t检验，P＜0.05 示差异有统计学意义。
冰冻切片过程中应用传统方法制片平均耗时3.87 min，而应用改进方法制片平均耗时2.42 min，两组在冰冻切片耗时方面比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在冰余组织处理过程中，传统方法中4 例发生标签纸脱落，而改进方法中所有标本均无标签脱落；
修蜡过程中，传统方法中的标记均在一定程度上变淡，而改进方法中的红色标签纸不受任何影响；
冰冻切片与石蜡切片中小病灶在传统方法与改进方法中的吻合率均达到100%，见表1。
表1 传统方法与改进方法在冰冻切片及相关的各项操作中的比较Tab.1 Comparison of traditional method and improved method in frozen section and related operations
随着医疗技术的不断进步，石蜡病理报告的准确率已经达到99.5%以上[3][4]，这有赖于切片质量的保证和多种检测方法的综合运用，而冰冻病理报告与其准确率的差距也在不断缩小，造成这种差距的部分原因在技术方面主要是因为冰余组织在经历石蜡包埋和石蜡切片过程后得到的组织切片与原冰冻切片上的组织结构发生了显著的变化：原病灶缺失或新的病灶出现，尤其是与较小病灶相关的诊断，其中甲状腺微小乳头状癌的小病灶在冰冻切片及后续相关的各项操作中偶尔就会发生遗漏的情况[5]。病理医生在术中送检的新鲜甲状腺组织中通过触觉或视觉就能准确发现具有诊断意义的小病灶，但不同性质的小病灶在新鲜离体取材时、低温冰冻切片时、高温浸蜡包埋时及常温石蜡切片时，其色泽可能会发生不同程度的变化，在没有显著标记的情况下，任何一个过程都可能对小病灶误判，从而引发相应的医疗差错。在冰冻切片过程中，为了更加便捷地制作质量合格的切片，通常会在已放置在样本头上的组织表面及周边滴加适量冷冻剂使组织在切片时受力均匀，冷冻剂凝固后组织的轮廓就难以辨识，因此传统方法切片过程中需要格外小心以避免小病灶被遗漏或切掉。在没有明确方位标记的情况下，可能会将其他区域结构或色泽上与之相似的小病灶发生误判[6]，从而造成切片不足或切片过度[7]。医生对质量不合格的切片通常建议重新切片，若样本头已经从机头上卸下，则需要重新安装，由于传统方法将样本头安装在机头上的角度并不固定，只有通过不断地调整机头角度来试切使其切面角度与原切面一致，尤其是在原组织切面已经呈现小病灶的情况下，这种有损的角度调整操作极有可能将小病灶破坏，而且工作效率较低。改进方法首先通过限定标签纸与样本头接触的角度关系，并进一步将较小病灶的中央区置于样本头中心与标签纸之间，这样即使小病灶被冷冻剂完全遮盖，参照放置规则就能将小病灶锁定在狭小的范围内，切片时只需将注意力集中在该区域就能快速准确的得到质量合格的冰冻切片，为准确的病理诊断提供可靠依据。在进行二次切片时，只需将样本头固定在机头上时使标签纸重新位于机头的12 点钟方向，然后调整刀口与机头上组织切面的距离即可进行正常切片操作，即使非同一技术员也能够在组织损伤极少的情况下快速准确地完成病理医生的制片要求，所以改进方法在二次切片过程中的工作效率和切片质量明显优于传统方法。
冰冻切片过程中无论组织中是否包含较小的病灶，传统方法均使用手工制作的白色标签纸，而在处理包含较小病灶的冰余组织时大多采用在其对应的包埋盒侧边用铅笔反复涂抹的方法进行标记，将冰余组织转移至包埋盒时有些粘附不牢的标签纸也会发生脱落的现象。已做标记的包埋盒在通过修蜡仪除去其周边多余石蜡的时候也可能会将标记磨损而变淡，从而影响石蜡切片时对标记蜡块的正确判断，容易忽略小病灶而造成过度修片。而改进方法在冰冻切片过程中选择红色衍纸作为标签纸，而且只应用于直径≤0.5cm 的小病灶，处理冰余组织时将红色标签纸放入包埋盒内即完成标记操作，石蜡包埋和石蜡切片时都能够及时发现该显著的标记，而且修蜡时不会影响红色标签纸。对比冰冻切片与石蜡切片中小病灶的一致性，传统方法与改进方法二者无明显差别。而且在标记包含小病灶的冰余组织方面，改进方法比传统方法更具灵活性，操作更简便。实践证明，应用改进方法能够使取材过程中发现的较小病灶在冰冻切片至石蜡切片的整个过程中得到快速准确地检测及最大限度地保护，工作效率和工作质量均得到了显著提高，这也体现了改进方法的设计在各个工作环节中的科学性和严谨性。为了达到理想的实验效果，工作中仍有以下几点需要注意：(1)标签纸的选择：标签纸具有一定的韧性和硬度以防止扯断，长度范围2.0～2.5 cm，宽度范围0.70～0.75 cm，超出此范围的标签纸将会给工作带来一定的不便，尤其是过长的标签纸在石蜡包埋过程中极易将超出包埋盒的部分搭落在其侧边上，可影响蜡块组织在石蜡切片机上固定的牢固程度，进而影响切片质量。直径≤0.5 cm 的小病灶选择红色标签纸，而直径＞0.5 cm 的小病灶选择白色标签纸。(2)标签纸的使用规则：①统一将标签纸上的编号起始端作为与样本头接触的部位，防止因冷冻剂滴加过多而遮盖病理编号的关键数字。②标签纸几何中心的长轴指向样本头的中心，提起标签纸后样本头的重心就在标签纸的垂线上，标签纸与样本头接触部位受力均匀而不易脱落，这正是改进方法中没有发生标签纸脱落的原因。③将直径≤0.5 cm 的小病灶的中央区置于样本头中心与红色标签纸之间，而直径＞0.5cm 的病灶可不受此限制，冰冻切片时使固定在机头上的样本头标签纸位于12 点钟方向，这样既方便样本头的装卸，又保护操作者避免手指被割伤。
在改进方法中对红色标签纸在样本头上粘贴的角度及其在机头上固定的角度进行规范操作，就能显著提高较小病灶在冰冻切片过程中的工作效率；
红色标签纸也为后续的石蜡包埋及石蜡切片过程中再次及时发现小病灶提供了重要的指示作用，既有效防止了小病灶在石蜡包埋过程中被遗漏的可能，又避免了小病灶在石蜡切片过程中被切掉的风险，使冰余组织的石蜡切片与冰冻切片在组织形态结构上达到最大程度地吻合，为提高二者病理诊断的吻合率进一步创造条件。目前甲状腺肿瘤[3]、肺肿瘤[8]、卵巢肿瘤[9]及眼睑小肿物[10]等组织进行术中冰冻切片的相关研究往往与冰冻制片速度、质量相关，而与诊断同样密切相关的冰余组织的研究却很少，本实验的改进方法具有通用性，其优势不因组织器官的种类、性质或大小而影响发挥。改进方法的应用并不仅限于疑有甲状腺微小乳头状癌的组织，它同样适用于组织中包含较小结节且该结节对病理诊断又具有一定意义的其他类型组织的冰冻切片及后续相关的各项操作。
