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强玲侠，陆 华，杨 茜，李方远，张 琦，苏先芝，黎欣韵
（成都中医药大学临床医学院 成都 610075）
桥本甲状腺炎又称为自身免疫性甲状腺炎（HT），是一种器官特异性自身免疫性疾病，其已成为一个全球公共卫生问题。全球患病率约为10-12%，影响了10倍以上的妇女[1-2]。在我国，HT的发病率为0.4-1.5%，约占甲状腺疾病的22.5%[3]，其中抗甲状腺过氧化物酶（TPOAb）阳性率为10.19%，抗甲状腺球蛋白（TgAb）阳性率为9.7%[4]。男女患病比为1∶（8-9），高发年龄在30-50岁[5]。桥本甲状腺炎是一种慢性炎症，同时伴有三级淋巴滤泡的发育和TPOAb和TgAb的循环自身抗体浓度的增加[6]。尽管女性流行的原因尚不清楚，但可以从女性性激素的作用中找到可能的解释。桥本甲状腺炎不仅是甲减的危险因素，还可伴发其他自身免疫性疾病，增加甲状腺肿瘤风险，对女性生殖健康也有影响[7]。
妊娠妇女甲状腺自身抗体阳性可以导致多种不良妊娠结局，如早产、流产等[8]。因而，生殖功能衰竭与HT的关系引起了广泛的关注[9]。近年来发现HT与反复着床失败有关[10]。HT改变子宫内膜容受性及子宫内膜腺体数量从而影响着床[11-13]。卵巢中存在甲状腺激素受体，故甲状腺激素对卵巢功能维持起重要作用[14]。卵巢是自身免疫性疾病中自身免疫攻击的目标，可损害卵巢功能和卵巢储备能力，具体机制尚不清楚。Chen等[15]表明中国女性特发性低卵巢储备与更频繁的TPOAb阳性相关，但与TPOAb水平无关；
与甲状腺功能或TgAb阳性无明显相关性。Košir Pogačnik等[16]发现HT组与对照组相比TPOAb、TgAb水平显著增加，同时证明HT和POI之间有相关性。
目前常用治疗方法多为发展至甲状腺功能减退症时予以口服左甲状腺素钠片及微量元素补充等，中医从肝脾肾三脏辨证论证此病。但尚未发现使用中药治疗对卵巢的影响的相关研究。本文通过动物实验探究中药对桥本甲状腺炎雌鼠卵巢功能的影响以减少不良妊娠发生，希望对临床工作提供新思路。
1.1 实验动物
昆明小鼠，雌性，8-9周龄，60只，体重20-30 g，由成都达硕实验动物有限公司提供（许可证号：SCXK（川）2020-030），饲料由成都达硕实验动物有限公司提供。饲养地点和实验单位为成都中医药大学SPF级妇科实验动物中心（SYXK（川）2019-049）。饲养环境通风良好，温度保持在20-24℃。
1.2 药物与试剂
实验所需药物如下：猪甲状腺球蛋白pTg（上海经科生物，JKH0040）；
弗氏不完全佐剂（IFA SIGMA，F5506-10X10ML）；
弗 氏 完 全 佐 剂（CFA SIGMA，F5881-10X10ML）；
磷 酸 盐 缓 冲 液PBS（biosharp，1XPBS缓冲液）；
碘化钠晶体（科密欧，Q/12HB 3847-2012）；
蒸馏水、接绪二天汤等。试剂配制：①高碘水:将0.64 g碘化钠晶体与1 L蒸馏水混合，配成浓度为0.64 g·L-1的高碘水；
②抗原溶液:将甲状腺球蛋白pTg抗原（1 mg/mL）溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中；
③初次免疫乳化剂:将弗氏完全佐剂和抗原溶液以1∶1体积比分别吸入2个注射器中，2个注射器交替推动，直至形成黏稠的乳化剂为止，使其最终浓度达500 mg·L-1，现配现用；
④加强免疫乳化剂：将弗氏不完全佐剂和抗原溶液以1∶1体积比，如同初次免疫乳化剂制备方法，制备成500 mg·L-1的油包水乳状液；
⑤中药制备：接绪二天汤由黄芪、淫羊藿、仙茅、艾叶组成，是陆华研究员自拟常用方。药物1剂合计46 g生药，人临床用量为1日1剂，按平均体重50 kg计算，相当于0.92 g生药·kg-1。实验过程中采用颗粒剂型，由华润三九医药股份有限公司制备。
1.3 主要仪器
病理切片：Leica ASP200S型全封闭自动脱水机、Thermo HistoStar自动包埋机、Thermo HM340旋转切片机、Thermo Shandon Gross-Star台式病理取材台、Leica全自动染色机。血清检测：电子分析天平（瑞士PRECISAXB220A）、组织研磨仪器HF-48（上海净帆）、电热恒温培养箱(武汉一恒苏净科学仪器;37度)、冷冻离心机（TGL16M台式高速冷冻离心机）、酶标仪（Rayto，RT-6100）、洗板机（Tianshi，988洗板机）、大龙0-1 mL单道移液枪、eppendorf 50-200 µL单道移液枪、eppendorf 0.5-10µL单道移液枪、大龙0-300µL八道排枪、TSH（210640M）及TgAb（210658M）、TPOAb（210609M）、FT3（210677M）、FT4（210676M）、AMH（210604M）、E2（210611M）、P（210668M）ELISA检测试剂盒（厂家均为：江苏酶免）。
2.1 动物模型建立
参考经典的抗原免疫诱导造模同时[17-19]，给予高碘环境，结合两种方法模拟自身甲状腺疾病，建立更接近临床症状的小鼠模型。将60只昆明雌鼠分为对照组、模型组、中药干预组各20只，每组又随机分组2个亚组（取材组10只、合笼组10只），适应性喂养1周后进行造模。第2周开始造模时予以高碘水喂养。除对照组外，其余2组小鼠于皮下（颈部、背部、大腿内侧、腹部等）多点注射含PTg（0.5 mg·mL-1）完全弗氏佐剂抗原共0.2 mL，连续2周，每周两次；
第3周起每只小鼠皮下注射PTg（0.25 mg·mL-1）不完全弗氏佐剂抗原0.2 mL，连续9周，每周两次；
共11周结束造模，后继续以高碘水喂养直至15周。对照组按照等量PBS缓冲液进行多点皮下注射11周。按照体表面积换算法，人和小鼠的药物剂量换算比值，中药干预组从造模第9周开始以给药浓度32.5 mg/ml的接绪二天汤灌胃，5次/周，1次/日至15周；
对照组与模型组灌胃给予等量生理盐水灌胃，灌胃周期同上。
2.2 标本采集
干预结束后，于造模15周各组取材组小鼠均选择动情前期取材。按用10%水合氯醛按0.4 mL/100 g进行腹腔注射麻醉，麻醉后眼眶采血，室温静置20 min后，以3000 r/min离取血清，分装后-80℃待测。酒精消毒小鼠颈部，分离气管并剥离甲状腺，去除筋膜和结缔组织；
沿下腹中线剪开，沿着阴道口寻找大鼠的“Y”字型子宫，沿着子宫的两个角向上寻找到左右卵巢，小心剥离子宫及卵巢周围脂肪组织，称取子宫、卵巢湿重后放入EP管，液氮速冻，-80℃待测。一侧卵巢用于冰冻切片HE染色，另一侧卵巢组织以备其它检测。
2.3 观察指标及检测指标
每周观察并记录每组小鼠体重、毛色、活动状态、排泄情况、饮水摄食情况、死亡情况、肛温等并详细记录实验过程中出现的异常情况。ELISA法检测促甲状腺激素（TSH）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺激素（FT4）、抗甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）、抗甲状腺球蛋白抗体（TgAb）、雌激素（E2）、孕酮（P）、抗缪勒管激素（AMH）等以探讨接绪二天汤对桥本甲状腺炎雌鼠卵巢功能的影响。合笼组小鼠以雌雄2∶1比例进行合笼，计数产仔总数及子代存活数。
2.4 统计方法
所有统计分析将采用SPSS 25.0统计分析，对照组-模型组、对照组-中药干预组比较使用单因素ANOVA进行比较分析。事后多重比较：假定方差齐性选择“LSD”，未假定方差齐性选择“Tamhane"s T2”，以P＜0.05为差异有统计学意义。
3.1 一般情况
与对照组相比，模型组小鼠从第9周开始出现饮水摄食欠佳，行动较迟缓，毛发稀疏有脱落现象，肛温较低，体重较轻，开始出现死亡现象，身体有不同程度皮下溃烂，同时伴有不同程度大便稀糖表现；
与模型组相比，中药干预组小鼠一般情况有所改善，体重、饮水摄食有所增加，皮肤及毛发情况较好，首次死亡出现在第10周且死亡总数较少，经中药干预后大便情况明显好转。
3.2 模型评估
对照组小鼠甲状腺细胞排列布局整齐，滤泡椭圆形，染色呈淡红，无异常浸润。模型组甲状腺镜下可见大小不均匀的甲状腺滤泡，滤泡上皮呈扁平状，滤泡内可见嗜伊红胶质，嗜酸性（红染），胶质厚薄不一；
可见中度程度淋巴细胞聚集，灶性滤泡破坏。中药干预组甲状腺可见大小不均匀的甲状腺滤泡，滤泡上皮呈低立方状，滤泡内可见嗜伊红胶质，嗜酸性（红染），胶质厚薄不一；
可见轻度淋巴细胞聚集，灶性滤泡破坏。甲状腺病理切片结果说明桥本甲状腺炎模型建立成功。
造模第7周开始出现乔甲炎特征，卵巢出现炎性表现趋势。于造模第9周发现乔甲炎特征趋向典型表现，卵巢慢性炎症较前明显，检测发现卵巢贮备功能有下降趋势。病理结果证明：乔甲炎可影响卵巢功能，导致储备功能下降。
3.3 对甲状腺的影响
造模后，模型组雌鼠血清TgAb、TPOAb明显高于对照组（P＜0.01），差异有统计学意义；
3组血清TSH、FT3、FT4值均处于正常值范畴，差异无统计学意义（表1）。
表1 各组血清TSH、FT3、FT4、TgAb、TPOAb比较（±s，n=8）
表1 各组血清TSH、FT3、FT4、TgAb、TPOAb比较（±s，n=8）
注：对照组与模型组比，**P＜0.01；
对照组与中药干预组比，△△P＜0.01；
模型组与中药干预组比，▲▲P＜0.01。
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3.4 对卵巢的影响
图1 各组小鼠甲状腺病理形态学变化（HE染色,×200）
图2 各组小鼠卵巢病理形态学变化（HE染色，×200）
与模型组相比，中药干预组血清E2、P升高（P＜0.05）、血清AMH明显升高（P＜0.01），差异有统计学意义（表2）。
表2 各组血清E2、P、AMH比较（±s，n=8）
表2 各组血清E2、P、AMH比较（±s，n=8）
注：对照组与模型组比，**P＜0.01；
对照组与中药干预组比，△P＜0.05，△△P＜0.01；
模型组与中药干预组比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
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中药干预组原始卵泡计数较模型组明显增加（P＜0.01），初级卵泡、次级卵泡及黄体数均增加（P＜0.05），闭锁卵泡减少（P＜0.05），差异有统计学意义；
成熟卵泡差异无统计学意义（表3）。
表3 各组卵巢各级卵泡计数比较（±s，n=8）
表3 各组卵巢各级卵泡计数比较（±s，n=8）
注：对照组与模型组比，*P＜0.05，**P＜0.01；
模型组与中药干预组比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
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与模型组相比，中药干预组卵巢湿重增加（P＜0.05）；
产仔总数增加（P＜0.05），存活数明显增加（P＜0.01），差异有统计学意义（表4）。
表4 各组子代数、存活数、卵巢湿重比较（±s，n=8）
表4 各组子代数、存活数、卵巢湿重比较（±s，n=8）
注：对照组与模型组比，*P＜0.05，**P＜0.01；
对照组与中药干预组比，△△P＜0.01；
模型组与中药干预组比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
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3.5 阳虚证型评价
与模型组相比，中药干预组小鼠体重从造模11周开始明显增加（P＜0.05），差异有统计学意义（表5）。
表5 各组小鼠静息状态下肛温（℃）
与模型组相比，中药干预组小鼠肛温从造模11周开始明显增加（P＜0.05），差异有统计学意义（表6）。
表6 各组小鼠体重增长情况（g）
结合本病特征，当属传统医学的“瘿病、虚劳”范畴。病因多为饮食水土失宜或先天体质、情志失调等。有学者指出：肾气先天不足，脾气后天失养为发病之本。疾病发展中以情志失和为诱因，肝郁化火伤阴可见阴虚诸证，病情迁延日久可致阴损及阳，最终可见脾肾阳虚诸证。故大多医家将本病发展分为肝郁化火、肝郁脾虚、脾肾阳虚3个阶段[20-22]。临床中多结合此分期对瘿病进行辨证论治。
在以往的报道中，肾阳虚与脾阳虚模型的症状表现基本一样，都有精神萎靡、倦怠少动、毛枯不荣、体重下降及体温降低等表现[23]。接绪二天汤是导师根据行医多年经验自拟常用方剂，外用及内服均可发挥作用。本方由黄芪、淫羊藿、仙茅等组成，致力于温补脾肾。经中药干预后小鼠体重增加（P＜0.05）、肛温上升（P＜0.05）、大便情况好转、皮肤及毛发情况改善可佐证药物对症并有效。从所表现的体重和体温下降及其该中药具有温补脾肾功效佐证，提示该模型有脾肾阳虚的病生理变化，具体尚需进一步研究。
结合国内外文献及我们前期预实验发现桥本甲状腺可以影响雌鼠卵巢功能。①从药物组成而言：淫羊藿的主要活性成分为淫羊藿苷，可促进雌二醇、孕激素分泌，改善内分泌水平[24]。淫羊藿苷也可以促进衰老小鼠卵泡发育，抑制卵泡闭锁，上调E2和AMH水平，减轻卵巢损伤，提高生育力[25-26]。黄芪补气健脾，淫羊藿补肾壮阳，两者相使为用共资先后天之本。仙茅及艾叶中含有黄酮类成分，现代药理研究表明其具有雌激素样作用。②从中医理论出发：肾藏精，主生殖，是人体生长发育、生殖的根本，精又为化血之源，直接为胞宫提供物质基础；
脾为气血生化之源，胞宫的孕、产、育都以血为用，四药协同对肾-天癸-胞宫-冲任轴起到调节作用。③实验结果显示中药干预组原始卵泡计数、初级卵泡、次级卵泡及黄体数较模型组均增加（P＜0.05或P＜0.01），血清E2、P、AMH升高（P＜0.05或P＜0.01），卵巢湿重、产仔总数、子代存活数均增加（P＜0.05或P＜0.01），送检卵巢组织中药干预组较模型组炎症明显减轻，从而说明接绪二天汤对桥本甲状腺炎引起的卵巢损害有改善作用。
目前公认桥本甲状腺炎是一种自身免疫性疾病，国内外研究以发现其作用机制为主，研究其对子宫的影响较多，相对缺乏其对卵巢影响的研究。并且临床未发展至甲减前未行相关系统的干预，也未发现特效药物。目前多项研究发现其对妊娠的不良影响，故必须探寻有效的干预措施。现有的治疗多以口服维生素、微量元素及左甲状腺素钠片为主，临床存在依从性差、心理抵触等问题。现在医疗发展中越来越重视中医药文化，更多的育龄期妇女选择孕前、孕中行中医调理及保胎治疗，对中医药有了更多的依赖。而目前对于HT引起的卵巢损害治疗很少使用中药，但其对育龄期妇女生殖相关影响不得不防，所以中药作用日益凸显，因而中药的动物实验研究对临床工作至关重要。故本实验研究中药对卵巢的作用，希望找到治疗此病的有效方法。现有研究凤毛麟角，本次实验属于小样本研究，尚缺乏精心设计的动物实验来阐明其作用机制而且小样本实验存在误差，仅对此病治疗提供思路。后期会再进行实验详细分析及研究药物机制，为中医药临床工作提供可行性证据。
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