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刘 畅，王盼盼，李少静，张艳菊，杜丽娜，杨 燕＊＊
（1.国家儿童医学中心 首都医科大学附属北京儿童医院 北京 100045；
2.杭州市中医院 杭州 310007；
3.中国航天科工集团七三一医院 北京 100074）
过敏性紫癜（Henoch-Schönlein purpura，HSP）是儿童时期常见的系统性血管炎，以皮肤紫癜、关节肿痛、消化道粘膜出血和肾损害为主要临床表现。其中50-75%的病变可涉及消化道[1]，出现腹痛、腹泻、呕吐、呕血、便血，甚至肠套叠、肠穿孔等消化道症状，称为腹型过敏性紫癜（Abdominal-type Henoch-Schönlein purpura,AHSP）[2]。
腹型过敏性紫癜属中医学“下血”、“肠风”范畴，临床以风热伤络、湿毒内蕴、脾虚不摄三证最为多见。大量文献已表明，中医学对HSP这一病因不详、症状各异、发病机制尚不明确的疾病，通过以证候为理论基础的特有的识病模式，在疾病早期辨识、鉴别诊断及治疗等方面显示了良好的优势，尤其是借助现代医学研究指标拓展了证候学研究的内涵。在前期AHSP中医药有效性的临床验证和中医宏微观辨证的证候学相关研究中，发现不同证候分类存在着各自的证候特点和生物学特性。但如何采用现代研究方法，建立宏观与微观相结合的证候分型系统，实现AHSP诊断、辨证的规范化和标准化，仍是临床亟需解决的问题。而蛋白是生命功能的执行者，不同证候预示着体内全套蛋白随时空和疾病状态不同而表达不同。蛋白质组学技术是研究生物系统全套蛋白表达差异的技术，可在中医证候宏观辨证的基础上，阐释机体的内在微观变化，发挥微观辨证的优势。
本研究即在探讨AHSP患儿不同证候临床特征的同时，基于非标记定量尿液蛋白质组学技术，对不同中医证候患儿的临床及尿液差异蛋白进行了分析，初步筛选及鉴定出潜在的证候差异蛋白，为AHSP证候诊断的客观化提供一定的依据。
1.1 一般资料
2016年5月—2017年12月住院于首都医科大学附属北京儿童医院中医科的患儿45例，其中男28例，女17例，男女比例为1.65∶1；
年龄≤7岁17例，7-10岁19例，＞10岁9例；
风 热伤 络证16例，湿毒 内 蕴证15例，脾虚不摄证14例；
同时期本院职工健康子女14例。本研究遵守赫尔辛基宣言伦理准则，并经首都医科大学附属北京儿童医院伦理委员会审批（伦理号NO.2016-91），所有患儿及正常儿童均知情同意。
1.2 诊断标准
（1）过敏性紫癜西医、中医诊断标准，参照《诸福棠实用儿科学》第8版[3]、《中华中医药学会·中医儿科常见病诊疗指南》[4]制定：①病前1-3周可有上呼吸道感染史，或药物、食物过敏史。②皮肤出现大小不等，淡红或暗红略突出皮肤之紫癜，下肢和臀部多见，呈对称性分布，可融合成片，常伴血管神经性水肿。③可伴有急性、反复阵发性腹痛，位于脐周或下腹部，可伴呕吐、便血，严重者并发肠套叠、肠梗阻、肠坏死或肠穿孔；
部分患者可同时伴有关节痛和尿检异常改变。④血小板计数正常或升高、出血和凝血时间正常、大便隐血可阳性、腹部B超见肠壁水肿，血沉轻度增快；
肾脏受累者尿液检查与肾小球肾炎类似。⑤除外其他疾病引起的血管炎及其他出血性疾患。
（2）腹型过敏性紫癜西医、中医诊断标准，参照过敏性紫癜诊断标准及文献制定：在符合过敏性紫癜诊断标准的基础上，至少同时伴有以下三项之一者：①急性弥漫性腹痛、呕吐等消化道症状，且非药物治疗难以缓解；
②消化道出血或大便潜血阳性；
③腹部B超显示不同部位、不同程度的肠壁水肿或腹腔渗出[5]。
（3）中医证候分类标准：参照《中华中医药学会·中医儿科常见病诊疗指南》[4]制定：①风热伤络证：发热，微恶风寒，咳嗽，食欲不振，紫癜好发于下半身，尤以下肢和臀部为多，常对称，颜色较鲜红，呈丘疹或红斑，大小形态不一，可融合成片，或有痒感，面部微肿，腹痛、便血，舌红，苔薄腻，脉浮数。②湿毒内蕴证：下肢皮肤满布瘀斑紫斑，腹部阵痛，口臭纳呆腹胀，或齿龈出血，大便溏，色暗红或褐紫，舌红，苔黄，脉滑。③脾虚不摄证：紫癜色淡红或反复发作，形体消瘦，面色不华，体倦乏力，食欲不振，自汗，小便短少，便溏，腹痛，甚或全身或下肢浮肿，舌淡，苔薄白，脉细弱或沉弱。
1.3 纳入和排除标准
纳入标准：①患儿符合AHSP西医、中医诊断标准及中医证候分类标准，对照组为正常儿童；
②患儿为住院患儿；
③年龄均在6-14岁；
④法定监护人知情同意。
排除标准：①合并HSPN（Henoch-Schonlein Purpura Nephritis，紫癜性肾炎）及入组前曾出现尿检异常者，包括镜下血尿、蛋白尿、血尿及蛋白尿或管型尿者；
②有胃肠、心、肺、肝、血液、精神、神经等系统原发病者；
③根据判断具有降低入组可能性或使入组复杂化者。
1.4 临床信息及尿样采集
详细观察并记录患儿的症状、体征及血、尿、便常规、血生化、凝血功能、腹部超声等检查结果，对患儿进行中医证候诊断。采集患儿入院第2天清晨清洁中段尿50 mL，采集正常儿童晨尿50 mL，均于-80℃保存；
按常规方法进行蛋白提取、测定、酶切等处理。
1.5 蛋白质组质谱分析
采用非标记定量方法（label-free proteomics quantifications，LFQ）进行蛋白质组质谱分析。每组5个样本采用数据依赖采集（data-dependent acquisition，DDA）方法进行预实验，其余39个样本采用数据非依赖采集（data-independent acquisition，DIA）方法进行蛋白质组分析，其中风热伤络证11例，湿毒内蕴证10例，脾虚不摄证9例，正常儿童9例。数据分析与处理通 过Mascot软 件、Scaffold软 件 及Proteome Discoverer、Spectronaut X软件进行。
1.6 统计学方法
所有数据均采用SPSS 25.0软件进行统计分析，以蛋白质表达变化倍数≥1.5或≤0.67、组间比较非配对t检验时P＜0.05为标准，二者同时满足时表示结果具有统计学意义。通过DAVAID数据库进行差异蛋白功能和通路分析。
2.1 不同证候首发症状比较
过敏性紫癜多以皮肤紫癜为首发症状，本研究中27例（60.00%）以皮肤紫癜首发，12例（26.67%）以腹痛首发，4例（8.89%）皮肤紫癜和腹痛同时出现，另有2例（4.44%）以皮肤紫癜及关节肿痛为首发症状。见表1。
表1 AHSP不同证候首发症状比较[例]
2.2 不同证候临床特征及化验检查结果比较
对不同证候的临床特征及化验检查结果进行比较，见表2。
表2 AHSP不同证候临床特征及化验检查结果比较
2.3 不同证候蛋白质组结果比较
2.3.1三证候间差异蛋白比较
采用方差分析法，对3个不同中医证候患儿的尿液蛋白进行比较及分析。当满足尿液蛋白方差分析P＜0.05，且变化率＞1.5时，通过DDA和DIA两种定量实验，三证候间分别获得91和73个差异蛋白，其中共同差异蛋白21个。经OPLS-DA（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，正交偏最小二乘法-判别分析）分析，AHSP的三个证候可被有效地区别开来。如图1所示。
图1 3种不同中医证候差异蛋白OPLS-DA分析结果。
2.3.2三证候间差异蛋白丰度的比较
对21个差异蛋白的丰度进行三证候间两两比较，当DDA、DIA结果同时满足P＜0.05时，认为该蛋白在两组间有显著差异。见表3。
表3结果显示，风热伤络、湿毒内蕴证间差异蛋白2个，风热伤络、脾虚不摄证间3个，湿毒内蕴、脾虚不摄证间16个。
表3 21个差异蛋白的丰度比较（P值）
2.3.3三证候间差异蛋白的鉴定
21个差异蛋白经OPLS-DA分析后，可鉴定出10个：ALDOB（果糖二磷酸醛缩酶B）、Glyc（丝氨酸羟甲基转移酶）、GSTA2（谷胱甘肽-S-转移酶A2）、GPDA（3-磷酸甘油脱氢酶）、GAPDH（3-磷酸甘油醛脱氢酶）、CRYL1（λ-结晶蛋白同系物）、AKR1A1（醛酮还原酶1-A1）、VMO1（卵黄膜外层蛋白1）、Cat S（组织蛋白酶S）、DHPR（二氢蝶呤还原酶）。对DIA实验中三证候及正常儿童组间10个差异蛋白的表达水平进行比较，如图2、表4。三证候间各自的差异蛋白数和共同差异蛋白数用韦恩图表示，见图3。
图3 三证候间各自的差异蛋白数和共同差异蛋白数
表4 DIA实验中三证候及正常儿童组间10个差异蛋白表达水平的统计量比较（P值）
图2 DIA实验中三证候及正常儿童组间10个差异蛋白表达水平比较
证候，作为中医学特有的识病模式，是中医临床辨证论治的精髓，是中医理法方药一脉相承的桥梁和关键。但是，基于传统中医理论的证候鉴别模式在临床实践中也遇到一定困难，如某一项指标不只反映单一证候的本质，某一证也不会只有单一指标的异常。一个证候包含了多脏器各指标间的复杂联系，很难用单一指标或某几个指标的简单叠加来解释证候的物质基础，也就无法全面客观地反映证候的本质。因此，借助兼顾整体性、复杂性等特性的组学技术，来进一步拓展证候学研究，就显得尤为重要。蛋白质组学技术的整体性、动态性、时空性、复杂性等诸多特征与中医证候学的特点十分吻合[6-8]，在证候学的现代探索中正发挥着越来越重要的作用。
“蛋白质组学”一词最早由Marc Wilkins于1996年提出，用于表示“基因组的蛋白质补体”[9]。基因的大部分功能信息都是通过蛋白质组来表征的，蛋白质组学就是对蛋白质组的表征，包括蛋白质在任一阶段的表达、结构、功能、相互作用和修饰。蛋白质是生物功能的效应因子，其水平不仅依赖于相应的mRNA水平，而且还依赖于宿主的翻译调控。因此，蛋白质组学包括了对基因组整体蛋白质特征的分析和分类[10]。
将蛋白质组学用于研究揭示中医证候间差异的生物学基础，以证实不同的证侯是不同功能的蛋白质参与其中的结果[11]。叶嘉豪等[12]从冠心病血瘀证、痰证、痰瘀互结证、气虚证、心肾阴虚证的蛋白差异表达进行评价，筛选出差异蛋白，探讨其诊断价值及证候发展规律；
对冠心病蛋白质组学实验提出规范检测标准、优化实验设计、创新技术手段等建议。
腹型过敏性紫癜蛋白组学研究相对较少，杨帆[13]曾以血液作为生物标志物研究的标本，对AHSP和急性阑尾炎以及正常患儿的血清蛋白，应用蛋白质组学的DIGE（Differential in-gelelectrophoresis差异凝胶电泳）和TOP/TOP-MS技术进行差异表达蛋白质组学的研究，最终识别出13个AHSP相关差异表达蛋白，有助于AHSP的早期诊断。但血液并非蛋白组学研究的理想标本[14]，尿液具有样本采集容易、无创、大量可用性、相对化学和物理稳定性等优点[15-16]，成为儿科蛋白质组研究中特别重要的工具。Jia等[17]曾采用定量蛋白质组学技术，比较了AHSP患儿与正常儿童的尿液蛋白质组，发现与正常儿童间存在75个差异蛋白，且其中10个曾被文献报道为肾脏、心血管、神经系统等其他21种疾病的候选生物标志物，与临床上过敏性紫癜患儿易出现肾脏、心脏、神经、肠、肝、胆、胰等器官合并症的特点极为相符。
本研究中AHSP不同证候的临床症状确有差异。临床特征显示，以皮肤紫癜为首发症状者，风热伤络证最多，湿毒内蕴者次之；
以皮肤紫癜伴腹痛为首发症状者，仅在脾虚不摄证中出现。不同证候间实验室指标均未出现统计学差异。
对照尿液蛋白生物标志物数据库检索差异蛋白的生物学信息，结果表明10个差异蛋白中的Cat S参与免疫反应，炎症和细胞外基质分解，损害微血管生长并参与血管疾病[18-19]；
DHPR参与氧化还原酶的活性；
GSTA2参与上皮细胞分化和白细胞介素-12介导的信号转导途径；
AK1A1参与氧化还原酶活性和糖酵解/糖异生。已有研究表明，炎症、免疫和氧化应激在HSP的病理生理过程中起着重要作用，因此这些生物标记物对AHSP不同证候的诊断及鉴别具有一定的特异性，值得引起重视。
Cat S是存在于动物组织细胞内的一类蛋白酶，尤其是溶酶体部分，它可以通过水解肽链、降解蛋白质而维持细胞内环境的稳定性。有研究发现Cat S与自身免疫性疾病密切相关，可能与其在炎症免疫、抗原递呈、血管生成、细胞增殖、细胞损伤、修复等病理、生理过程中发挥的功能有关。Cat S基因缺陷的小鼠可表现为微血管发育不足，其参与微血管的形成，主要作用于细胞外基质的降解过程[19]。本研究中图2、表4显示，与正常儿童组相比，Cat S水平在三证候中均呈上调趋势，但仅风热伤络证差异具有统计学意义，提示Cat S可能是风热伤络证的证候差异蛋白，其水平上调可作为风热伤络证的参考指标之一。同时，Cat S水平的上调与自身免疫异常和系统性微血管炎症有关，风热伤络、脾虚不摄、湿毒内蕴三证中的Cat S水平依次减低，在一定程度上表明外邪致病可能引发较为严重的炎症反应及血管损伤。
DHPR可以增强HEK293T细胞（Human embryonic kidney cells 293T，人胚胎肾细胞293T）自噬相关基因LC3和Beclin1的表达，表明其可能存在诱导细胞自噬的作用。自噬是细胞通过溶酶体对自身损伤、衰老的细胞器进行吞噬降解的过程，自噬途径的激活对细胞有保护作用，但过度激活也可能引起细胞自身的凋亡[20]。此外，DHPR在体外的高表达可抑制细胞的氧化应激，以调节细胞凋亡过程[21]。自身免疫性疾病可能与细胞的自噬有关，但具体机制有待进一步研究。本研究中图2、表3、4显示，与正常儿童组相比，DHPR水平在脾虚不摄证、风热伤络证均明显上调，但两组间无差异，而脾虚不摄证与湿毒内蕴证组间差异有统计学意义，提示DHPR可作为两证与湿毒内蕴证的差异蛋白加以鉴别，且脾虚不摄证上调更显著，其上调的程度可能有助于与风热伤络证进行区分。而湿毒内蕴证DHPR水平无上调，亦符合文献中湿热证可导致细胞自噬水平下降的报道[22]，或可作为湿毒内蕴证的参考指标之一。
VMO1的功能尚不明确，部分学者研究发现该蛋白在许多外分泌腺和分泌物中含量丰富，例如胰腺、脑脊液、尿液、呼吸道分泌物等，人体泪液中也存在着微量的VMO1[23]。本研究中图2、表3、4显示，与正常儿童组相比，VMO1在三证候中呈整体下调趋势，均有统计学意义，且湿毒内蕴证下调最多，脾虚不摄证下调较少，两证间差异有统计学意义，提示VMO1下调的程度可能有助于区分湿毒内蕴证与脾虚不摄证。
AK1A1广泛分布于多种体内组织中，具有重要的生物学作用，对多种活性醛具有催化活性，参与调解氧化应激水平[24]。在腹型过敏性紫癜患儿中，AK1A1参与氧化还原酶活性和糖酵解/糖异生过程，其尿液中水平明显高于正常组。图2、表4显示，与正常儿童组相比，风热伤络证、脾虚不摄证AK1A1水平均上调，湿毒内蕴证无上调，提示AK1A1可作为风热伤络证、脾虚不摄证两证与湿毒内蕴证的差异蛋白加以鉴别；
同时，表3显示风热伤络证与湿毒内蕴证组间差异有统计学意义，与脾虚不摄证组间无差异，说明风热伤络证AK1A1水平上调更显著，其上调的程度可能有助于与脾虚不摄证进行区分。
本研究以蛋白质组学技术为基础，以AHSP的证候特征为研究切入点，通过研究AHSP不同证候尿液蛋白的差异，阐述生物标记物与疾病、中医证候间的相互关系，为证候研究提供蛋白质组学的实验室依据，值得进一步深入探讨。
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