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李娟娟 张超
胃癌是一种具有较高发病率的消化系统恶性肿瘤，因发现时一般失去手术机会，其死亡率较其他恶性肿瘤明显升高[1]。有资料显示，早期胃癌患者的5 年生存率可达90%以上，但胃癌总体生存率只有30%左右，其中导致中晚期胃癌患者生存率下降的主要原因系恶性肿瘤细胞的转移或复发[2]。因此，临床需及早发现和明确患者病情，并对其进行进行有效地治疗，从而延长患者生存时间，改善患者预后。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）一般通过两种途径进入外周血循环：一是直接脱落于恶性肿瘤的原发病灶，二是脱落于恶性肿瘤的转移病灶，脱落的肿瘤细胞可随血液循环流动，从而导致肿瘤的种植及转移[3]。据有关资料显示，通过对乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤患者，实施外周血CTCs 检测，结果显示均检出了CTCs，提示CTCs 在恶性肿瘤的发生发展过程中起到了重要作用，临床通过测定患者的CTCs 水平，能够为临床疾病筛查、方案制定以及预后预测提供重要帮助[4]。另外，外周血CTCs检测能够较常规检查更早地发现微小肿瘤细胞转移，有助于及早发现肿瘤发展状况，为患者预测预后、选择化疗和靶向治疗提供重要参考，从而改善患者预后[5]。为了解莱尔(Cyttel)检测法对外周血CTCs 的检测情况及意义，本文选取了50 例蚌埠医学院第二附属医院收治的50 例胃癌患者和40 例胃部良性疾病患者，对其外周血CTCs 检测结果与病理特性研究如下。
1.1 一般资料
纳入胃癌患者50 例，均于2019 年1 月—2021 年1 月在蚌埠医学院第二附属医院接受治疗。其中男性27 例，女性23例，年龄28～81 岁，平均（57.46±3.98）岁。肿瘤分期为Ⅰ期15 例，Ⅱ期22 例，Ⅲ期13 例。肿瘤直径2～9 cm，平均（4.56±0.83）cm。分化程度：低分化28 例，中-高分化22 例。另选取同期本院胃部良性疾病患者40 例为对照组，其中男24例，女16 例，年龄27～80 岁，平均（58.01±3.96）岁。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），有可比性。
纳入标准：（1）均经病理等检查确诊。（2）患者临床资料完整。（3）既往无其他恶性肿瘤。（4）自愿参与本研究。排除标准：（1）严重心脑血管疾病。（2）实验室检查合并肝肾功能异常。（3）存在严重器质性病变。（4）接受抗肿瘤治疗者。（5）中途退出研究或不配合研究者。患者及家属知晓研究并签署同意书，本研究经医院伦理委员会批准。
1.2 方法
Cyttel 检测方法：在进行治疗前，均对穿刺部位进行严格消毒，将采集的4 mL 外周静脉血置于抗凝管中，室温保存，所有标本均必须在24 h 内完成检测。使用Pico15 型高速离心机（美国赛默飞世尔科技公司）。将采集的血样放置在离心管中，加入45 mL 的磷酸盐缓冲液，以2 000 r/min 的速度对其进行离心处理，离心5 min 后，除去上清液。然后将300 μL 的磷酸盐缓冲液加入试管中，对细胞沉淀进行重悬处理。完成上述操作后，选择适量的磁珠，加入一定的细胞沉淀后，通过水平倾斜摇晃使其能够充分结合。抽取3 mL 的分离介质，将其加入到离心管中，待其与上述悬液完全叠加后，对其实施离心处理。吸取稀有细胞层至离心管，以2 000 r/min 的速度对其进行5 min 的离心处理，然后弃去上清液，加入1 mL 的磷酸盐缓冲液，将其转移至2 mL 的离心管中，并静置2 min。之后将其转移至1.5 mL 的离心管中，离心处理（2 000 r/min，离心5 min）。离心后弃去上清至100 μL，另添加100 μL 固定液，混匀，最后常规涂片、干燥，24 h 内对其进行免疫荧光原位杂交（immuno fluorescence in situ hybridization，imFISH）鉴定。
imFISH 鉴定：将制作好的载玻片常规进行固定、脱水等处理，加入10μL 的17 号染色体双探针（chromo-some 17 enumeration probe，CEP-17），封片后进行杂交，时间为1.5 h。操作完成后使用甲酰胺工作液除盖玻片，并进行探针洗脱与洗涤等处理，在样本区加入提前配置的白细胞共同抗原（leukocyte common antigen，CD45）荧光抗体（江苏莱尔生物医药科技有限公司），于33℃条件下孵育1 h。吸除荧光抗体后，在标本区滴加10 μL 的4"，6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美国Sigma Aldrich 公司），并予以封片等处理，荧光显微镜下观察具体情况。
CTCs 判读标准：荧光显微镜下观察，符合以下标准即可诊断为CTCs 阳性[6]：（1）细胞膜CD 45 染色结果为阴性。（2）DAPI 染色处理后显示核染色效果较佳，核不论是大还是小，均为较确定的核。（3）细胞核CEP-17 信号超过2 个（两信号点间距＜单个信号点直径视为1 个信号点）。（4）细胞表面无磁珠结合，或只有1 个磁珠结合。（5）不存在胞核聚集、叠加或杂志感染情况。
1.3 观察指标
统计研究组与对照组的CTCs 阳性与阴性例数，比较其阳性率=阳性例数/总例数×100%，并比较研究组中阳性与阴性患者的年龄、性别、分化程度、脉管侵犯、肿瘤分期、淋巴结转移、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9）及糖类抗原72-4（carbohydrate antigen 72-4，CA 72-4）等资料。
1.4 统计学方法
采用SPSS 24.0 统计学软件分析数据，计数资料以n（%）表示，行χ2检验或Fisher 确切概率法，计量资料以（）表示，行t检验，P＜0.05 则差异有统计学意义。
2.1 两组外周血CTCs 阳性率比较
经检测发现，研究组50 例胃癌患者中检出CTCs 阳性36 例，其CTCs 阳性率为72.00%（36/50）。对照组40 例患者中只有4例检出CTCs，对照组CTCs 阳性率为10.00%（4/40），两组间阳性率比较，χ2=34.596，差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.2 胃癌患者外周血CTCs 阳性与临床病理特征的关系
胃癌患者中外周血CTCs 阳性患者的年龄、性别、分化程度、肿瘤分期及淋巴结转移与阴性患者相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。CTCs 阳性与CTCs 阴性患者的CEA、脉管侵犯、CA 19-9 及CA 72-4 比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。
表1 研究组胃癌患者外周血CTCs 阳性与临床病理特征的关系[例（%）]
胃癌是一种起源于胃黏膜细胞的恶性肿瘤，在中老年群体中发病率较高。近年来，随着经济发展和人们生活方式转变，胃癌发病率以及病死率均具有显著上升趋势。早期发现和诊断胃癌，有助于及早控制患者病情，降低患者病死率，对患者预后改善具有显著意义。目前临床可用于该疾病诊断的方法较多，如血清肿瘤标志物、影像学、胃镜以及脱落细胞学检查都是临床用于胃癌诊断的常用方法，但是存在早期诊断率低的情况，导致大部分患者在确诊时已经进展至中晚期，存在肿瘤转移的情况，导致治疗效果、预后欠佳[7]。加之患者自身对疾病不够重视，且胃镜检查存在费用高、耗时长和不适强等不足，导致部分患者不愿意配合胃镜检查，耽误治疗，导致疾病进展。因此，选择更为合适的方法及早诊断该疾病具有必要性。肿瘤细胞在进入血液时很快就会死亡，只有少部分活力及转移能力较强的肿瘤细胞才 能够得以存活，且在一定条件下聚集，进一步形成转移灶，这也是肿瘤发生远处转移的最主要形式。有研究提出，来源于上皮组织的癌细胞，在上皮间质转化后，具备迁移和侵袭血管的能力，通过对外周血CTCs 进行检测，能够及早发现患者的病灶转移情况，较影像学更早地发病异常，从而及时予以有效控制，为患者治疗争取更多时间[8]。大部分情况下，由于受到机体微环境的影响，CTCs 进入到外周血会出现凋亡的情况，只有少部分在抵达适合身材的部位后，才会发生转化，并重新获得相应特性，形成新的转移病灶。在各种因素的共同影响下，CTCs 可出现免疫逃避的情况，导致免疫杀伤细胞无法对其进行监控与识别，导致其不断向远处转移。
CTCs 作为一种具有肿瘤细胞，携带了肿瘤的所有分子生物学信息，对其实施动态监测，可动态反映各阶段的肿瘤变化情况。有资料显示，CTCs 阳性与脉管内癌栓具有较大关系，说明肿瘤可侵袭患者的脉管系统，可为肿瘤的进一步转移创造条件，及早测定外周血中CTCs 情况，能够反映肿瘤的早期发生和转移，可作为早期诊断胃癌的敏感指标[9]。CTCs 作为判断肿瘤转移的重要条件，能够为乳腺癌、结肠癌等诸多恶性肿瘤的转移预测及疗效评定提供重要依据。由于CTCs 检测具有安全无创、操作简便以及特异性高等优势，CTCs 已经成为评估肿瘤转移风险的重要标志物。就目前来看，临床可用于CTCs 检测的方法较多，尤其随着分子生物学技术的快速发展，CTCs 的检测呈现手段多样化，基于免疫亲和富集法和基于生物物理特性富集法是两种最为常用的方法，敏感性和特异性均较高，临床可根据具体需要选择合适的检测方法。本文研究过程中，采用了Cyttel 公司的CTCs 分离检测技术，对90 例研究对象的外周血CTCs 情况进行检测，结果显示：研究组胃癌患者的CTCs 阳性率显著高于良性疾病对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明采用该方法检测具有较高的外周血CTCs检出率，分析其原因可能在于：（1）Cyttel 法检测能够尽可能保留患者血样本中的稀有细胞，最大限度去除了白细胞，以便更为准确地检出外周血CTCs[10]。（2）在肿瘤细胞和健康血液中CD45 表达存在较大差异，在健康血液中该指标通常表达为阳性，在肿瘤细胞中会表现为阴性，且染色体前者为2 倍体，后者为多倍体，所以在检测过程中稀有细胞的染色和杂交等处理充分利用了该特性，能够显著提升临床对外周血CTCs 的检出率[11]。（4）与传统方法相比，Cyttel 法能够有效减轻上皮-间充质转化对细胞黏附因子的影响，有助于准确鉴别外周血CTCs，从而提升其阳性检出率[12]。本研究显示，胃癌患者的外周血CTCs 阳性与年龄、TNM 分期、性别、淋巴结转移、分化程度无关，但是与患者的CEA、CA19-9、CA72-4 及脉管侵犯有关，说明胃癌患者的CTCs 高表达与脉管侵犯、肿瘤标志物水平有关，脉管侵犯的胃癌患者具有较高的远处转移风险。CEA、CA19-9、CA72-4 是临床诊断胃癌的重要标志物，本研究结果也同样证实，肿瘤标志物水平越高，患者的CTCs 阳性率越高，提示胃癌患者的肿瘤远处转移风险亦越高。由此可见，临床可通过检测患者的外周血CTCs 表达情况，及时了解患者的肿瘤发生以及转移情况，进而为临床诊断及治疗方案制定提供有价值的参考信息。另外，通过监测患者的外周血CTCs 表达情况，能够为患者的个性化治疗提供指导，从而增强临床治疗效果。
总之，CTCs 是胃癌患者肿瘤转移的基础，采用Cyttel 法能够较为准确地检出其外周血CTCs 阳性，且通过对其外周血CTCs 进行监测，有助于准确预测胃癌患者的肿瘤转移情况，具有较高应用价值。
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