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刘旨浩 王宇虹 王钧 周慧鑫 于中洋 张嵩 矫鹂莹 聂鹂庆 王悦怡 江洪 余锂镭
生物钟几乎存在于哺乳动物的所有细胞中，通过一系列复杂的转录-翻译反馈环路（TTFL）实现组织和器官功能上的昼夜波动[1]。这些TTFL 主要由核心时钟基因（Bmal1、Clock、Per1、Per2、Cry1和Cry2等）和钟控基因（Nr1d1、Nr1d2、Rorα和Tim等）相互作用形成，共同调节机体行为的昼夜节律[1]。研究表明，心肌梗死后猝死事件的发生具有明显的昼夜分布，其潜在机制尚不清 楚[2-3]。既往研究发现，左侧星状神经节（LSG）是心脏交感神经过度激活并触发心肌梗死后猝死事件的关键环节[4]。本研究旨在探究心肌梗死对比格犬LSG 时钟基因表达的影响。
1.1 实验动物及分组
12 只健康成年雄性比格犬由武汉大学人民医院动物中心提供，体质量为18～22 kg，饲养于温度和湿度适宜的环境中，光照周期为光照和黑暗各 12 h。12 只比格犬随机分为心肌梗死组（MI 组，行左前降支结扎术，n＝6）和对照组（仅开胸不结扎动脉，n＝6），本研究方案由武汉大学动物实验伦理委员会批准进行。
1.2 建立心肌梗死模型及取材
所有比格犬通过前肢静脉注射3%戊巴比妥（剂量为30 mg/kg）进行麻醉，并以2 mg/（kg·h）维持麻醉状态。麻醉后将比格犬置于手术台，行气管插管连接正压呼吸机通气，调整氧流量4～ 6 L/min。右侧股静脉置管建立静脉通道，滴注生理盐水。持续监测体表心电图（Lead7000，四川锦江电子科技有限公司）。整个实验过程中，于比格犬下方放置电热板以维持正常体温。所有比格犬取右侧卧位，经左侧第四肋间开胸，剪开心包，暴露心脏。小心分离冠状动脉左前降支，在距离左前降支起始处约2 cm 的下方穿入1 根3/0 线，结扎左前降支建立心肌梗死模型。模型建立成功标志：心肌缺血区域出现局部发绀，心电监测示Ⅱ导联ST 段明显改变（≥0.1 mV 抬高或压低）。保持结扎1 h。对照组比格犬行相同操作但不结扎。安乐死处死动物，于左侧第三肋间开胸，收集LSG，解剖学位置如图1 所示，所有比格犬的取材操作均于20∶00～24∶00 间完成。
图1 左侧星状神经节的解剖位置
1.3 时钟基因检测
Trizol 法提取总RNA，使用逆转录试剂盒将总RNA 逆转录为cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix 进行荧光实时定量聚合酶链反应（qRTPCR），引物由上海生工生物工程公司提供，引物序列见表1，实验条件为95 ℃ 10 min 预变性，95 ℃ 15 s 变性，60 ℃ 30 s 退火/延伸，40 个循环。以GAPDH 作为内参，用2-ΔΔCt法计算基因的相对表 达量。
表1 qRT-PCR引物序列
1.4 统计学分析
使用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析，所有数据均通过Shapiro-Wilk 检验是否符合正态分布。数据均以均数±标准差表示，采用独立样本t检验对组间差异进行比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 心肌梗死对LSG中核心时钟基因表达的影响
与对照组相比，MI 组Per2的mRNA 表达水平显著降低，Cry1、Cry2的mRNA 表达水平显著升高（P均＜0.05），Bmal1、Clock和Per1的mRNA 表达水平变化不显著。见表2。
表2 2组LSG中核心时钟基因mRNA表达水平比较
2.2 心肌梗死对LSG中钟控基因表达的影响
与对照组相比，MI 组Nr1d1的mRNA 表达水平显著降低，Tim的mRNA 表达水平显著升高，（P均＜0.05），Nr1d2、Rorα的mRNA 表达水平变化不显著。见表3。
表3 2组LSG中钟控基因mRNA表达水平比较
近年来，心肌梗死在我国的发病率及病死率呈上升趋势[5]。研究表明，心肌梗死后猝死事件（如室性快速性心律失常）的发生具有明显的昼夜分布特点，表现出典型的清晨发病高峰，但其机制尚不清楚[2-3]。既往研究显示，心脏交感神经节即LSG的过度激活是心肌梗死后猝死事件发生的重要环节，LSG 的神经活性同样具有昼夜节律性[6]，提示心肌梗死后猝死事件发生的昼夜分布可能与LSG的昼夜节律相关。
哺乳动物的生物钟系统由位于下丘脑视交叉上核（SCN）的中央时钟与位于外周组织中的外周时钟构成[7]。其中，中央时钟是控制机体昼夜节律的主要部分，其通过视网膜接受光信号实现与外界环境的同步，并经神经体液途径（自主神经张力、体温和糖皮质激素等）整合外周时钟，从而使机体与环境、不同器官间保持同步，调节生理活动。本团队前期通过将跨突触逆行示踪病毒——伪狂犬病病毒注射至大鼠心肌组织中，发现颈上神经节（SCG，与LSG 功能类似）、下丘脑室旁核（PVN，交感神经中枢）和SCN 处均出现了伪狂犬病病毒标记的神经元，说明可能存在“SCN-PVN-SCG-心脏”交感神经轴，进一步研究发现昼夜节律紊乱可通过激活该交感神经轴，使心肌梗死后的心脏重构恶化，提示心脏交感神经节可以直接受到中央时钟的调控，从而影响心肌梗死后心脏功能的改变[8]，然而目前关于心脏交感神经节的外周时钟基因在心肌梗死前后的改变情况仍不清楚。为了更好地反映人类LSG 时钟基因在心肌梗死前后的表达改变，本研究采用了与人类生活作息相同（昼出夜伏）的比格犬作为实验动物，通过结扎左前降支构建心肌梗死模型，发现MI 组LSG 中Per2、Nr1d1的表达显著降低，Cry1、Cry2、Tim的表达显著升高。
在生理状态下，核心时钟基因及钟控基因通过形成一系列复杂的TTFL 实现昼夜波动[9]。核心TTFL 主要由4 个核心时钟基因蛋白驱动：2 个正向调节因子（Bmal1 和Clock）和2 个负向调节因子（Per 和Cry）。首先，核心时钟基因蛋白Bmal1 和Clock 在细胞核中结合形成异二聚体，并与Cry和Per基因启动子区域的E-box 结合，激活它们的转录。随后，Per 和Cry 蛋白在细胞质中聚集，结合形成异二聚体并重新转移至细胞核中，抑制Bmal1-Clock 异二聚体介导的基因转录过程[9]。除此之外，Bmal1-Clock 异二聚体还可以激活钟控基因（如Nr1d1、Nr1d2、Rorα）的转录，而Nr1d1/Nr1d2 和Rorα 的积累又可以通过与Bmal1启动子区域的核受体反应元件结合，分别抑制和促进Bmal1的表达，进一步维持该反馈环路的稳定性[10]。本研究结果显示心肌梗死会导致LSG 核心时钟基因的负向调节因子Per2表达显著降低，Cry1、Cry2表达显著升高，而正向调节因子Bmal1和Clock的表达则无明显改变。本研究同样发现心肌梗死会导致LSG中钟控基因的负向调节因子Nr1d1表达显著降低，而对正向调节因子Rorα的表达无明显影响。这些结果提示心肌梗死主要影响LSG 内TTFL 负向调节因子的表达。
Tim基因最初在果蝇中被发现，其编码的Tim蛋白主要通过与Per 蛋白结合，以异二聚体的形式转入细胞核中抑制Per基因的转录，从而参与维持果蝇正常的昼夜节律[11]。目前关于Tim 蛋白在哺乳动物中的作用尚不清楚。Barnes 等[12]通过选择性敲除小鼠SCN 中Tim基因发现，Tim表达下调可显著降低Per 蛋白的表达，升高Cry 蛋白的表达，并严重破坏SCN 的昼夜节律，表明Tim很可能也参与了哺乳动物昼夜节律的维持。除了驱动昼夜节律外，近年来研究表明Tim 还与细胞周期、DNA复制及DNA 损伤有关[13]。本研究发现心肌梗死显著地增加了LSG 中Tim基因的转录水平，但降低了Per2的表达，升高了Cry1/Cry2的表达，这与Barnes 等[12]的研究结果并不一致，提示心肌梗死很可能是通过其他机制影响Tim的表达，其中的潜在机制需要进一步研究。
综上所述，本研究发现心肌梗死主要影响LSG内TTFL 的负向调节因子（Per2、Cry1、Cry2及Nr1d1）的表达，推测这可能与心肌梗死后猝死事件发生的昼夜分布有关。后续研究将进一步验证LSG 内TTFL 的负向调节因子的表达改变与猝死事件发生的联系及潜在机制。此外，基于Tim 在心肌梗死前后的显著改变，我们推测Tim 很可能参与了该过程。
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