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姚程晨，杨丽梅，林立
（北京市食品安全监控和风险评估中心（北京市食品检验所），国家食品质量安全监督检验中心，北京 100094）
我国每年出生的新生儿中都会有部分新生婴儿由于受各种疾病的影响，其生命初期或相当长一段时间里母乳或其他普通婴儿配方食品不能完全满足其所需的营养需求，而特殊医学用途婴儿配方食品的出现不仅可以提供这部分新生婴儿所需的营养，也可以作为其赖以生存的唯一或主要的食物来源[1-3]。牛磺酸又称β-氨基乙磺酸，分子式为HO3S-CH2-CH2-NH2，分子量为125.2 u，对人体起着十分重要的生理调节作用，尤其是增强免疫力和抗疲劳。牛磺酸可以引起代谢物的变化，具有稳定性强、抗氧化能力，可被作为生化试剂和润滑剂来使用，缺乏牛磺酸会引起视网膜功能紊乱[4-12]。
目前测定牛磺酸的主要方法有氨基酸分析法、分光光度法、高效液相色谱质谱串联法、傅立叶变换红外线光谱法[13-17]等。特殊医学用途配方食品在世界各国均作为特殊膳食用食品进行管理[18-19]，2015年起我国逐步完善对特殊医学用途配方食品的监管，并明确了其作为食品的法律属性[20]。针对婴幼儿配方乳粉样品可依据标准GB 5009.169-2016《食品安全国家标准食品中牛磺酸的测定》第二法丹磺酰氯柱前衍生法进行检测[21]。但是特殊医学用途婴儿配方食品样品复杂，牛磺酸受基质干扰明显，分离度差，衍生不充分，检测结果不理想[22-24]。
本方法在国家标准GB 5009.169-2016《食品安全国家标准食品中牛磺酸的测定》第二法丹磺酰氯柱前衍生法的基础上对特殊医学用途婴儿配方食品样品稀释后再进行衍生优化，选用资生堂CAPCELL PAK C18色谱柱分离效果好，可以很好的消除其他氨基酸引起的基质干扰，满足分析要求。
1.1 仪器与材料
1.1.1 样品
市售的特殊医学用途婴儿配方食品，包括：无乳糖配方或低乳糖配方，乳蛋白部分水解配方，乳蛋白深度水解配方或氨基酸配方，早产、低出生体重婴儿配方。
1.1.2 试剂与标准品
亚铁氰化钾（分析纯）、乙酸锌（分析纯）、盐酸（分析纯）、甲胺盐酸盐（分析纯）、乙酸钠（分析纯）、冰乙酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；
无水碳酸钠（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司；
丹磺酰氯(色谱纯)，美国Alfa Aesar公司；
乙腈(色谱纯)，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；
牛磺酸标准品（Taurine，CAS：107-35-7，纯度：99.8%），sigma。
1.1.3 仪器与设备
安捷伦高效液相色谱分析仪1260（配有二极管阵列检测器（DAD）以及荧光检测器（FLR）)及OpenLAB CDS ChemStation Edition for LC & LC/MS Systems数据处理系统)，美国安捷伦公司；
百分之一分析天平（型号ME802，d=0.01 g)、千分之一分析天平（型号ME203T，d=1 mg），瑞士梅特勒公司。
1.2 实验方法
1.2.1 标准曲线的配制
称取约10 mg牛磺酸标准品，用水溶解并定容至100 mL。将牛磺酸标准储备液用水稀释配制成浓度分别为：1、2、10、20、50 μg/mL一系列标准曲线工作液，临用前现配。
1.2.2 试剂配制
碳酸钠缓冲液：称取0.424 g无水碳酸钠，加40 mL水溶解，用盐酸溶液调pH至9.5，用水定容至50 mL。
丹磺酰氯溶液：称取0.15 g丹磺酰氯，用乙腈溶解并定容至100 mL。临使用前配制。
甲胺盐酸盐：取2.00 g盐酸甲胺，用水溶解并定容至100 mL。
乙酸钠缓冲液：称取0.82 g乙酸钠，加入800 mL水溶解，用冰乙酸调节pH至4.2，用水定容至1 000 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤。
1.2.3 样品处理
准确称取2.50 g（精确到0.01 g）待测样品，用20 mL 40℃左右的温水溶解后振荡混匀超声提取，再分别加入1 mL乙酸锌溶液和1 mL亚铁氰化钾溶液摇匀，继续振荡，用超纯水定容至50 mL，摇匀，8 000 r/min离心10 min，取上清液备用。
1.2.4 样液稀释、衍生
取上清液用水稀释10倍后待用。吸取1 mL待测液到玻璃试管中，加入1 mL碳酸钠缓冲液，以及1 mL丹磺酰氯溶液，充分振荡混合，室温避光衍生反应2 h（1 h后需摇晃1次），加入0.1 mL盐酸甲胺溶液涡旋混合，以终止反应，避光静置至沉淀完全。取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤后供高效液相色谱分析仪检测。
另取标准曲线工作液用水稀释10倍摇匀待用，取1 mL与试液同步进行衍生。供高效液相色谱分析仪检测。
1.3 色谱条件
色谱柱：资生堂CAPCELL PAK C18色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)；
流动相流速：1.0 mL/min；
柱温：30℃；
进样量：20 μL；
检测器及波长：二极管阵列检测器，254 nm；
流动相：乙酸钠缓冲液+乙腈,梯度洗脱程序如表1所示。
表1 牛磺酸的洗脱梯度表
1.4 结果计算
按照下式计算试样中牛磺酸的含量：
式中：X为试样中牛磺酸的含量(mg/100 g)；
c为试样测定液中牛磺酸的浓度(μg/mL)；
V为试样定容体积(mL)；
m为试样质量(g)，100为将结果单位由毫克每克换算为毫克每百克样品中含量的换算系数；
1 000为将浓度单位由ng/mL换算为μg/mL的换算系数。
2.1 色谱条件的优化
同时比较了Agilent zorbax Eclipse XDB-C18（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱、Agilent zorbax SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱和资生堂CAPCELL PAK C18（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱对目标化合物分离的影响。如图1所示，牛磺酸在XDB-C18柱和SB-C18上分离度较差；
在PAK C18柱上分离度均较好，所以最终选择资生堂CAPCELL PAK C18（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱进行分析。
图1 不同色谱柱分离牛磺酸的液相色谱图
流动相的选择对目标化合物的分离、峰形有很大的影响。本文研究比较了10 mmol/L乙酸钠水溶液和乙腈的等度洗脱和梯度洗脱对牛磺酸色谱峰的影响。实验发现特殊医学用途婴儿配方食品基质复杂等度洗脱无法很好分离牛磺酸目标峰，对于结果数据有明显的影响，而流动相梯度洗脱的牛磺酸分离度较好、响应值高，因此选择10 mmol/L乙酸钠水溶液和乙腈的梯度洗脱作为流动相。
2.2 蛋白质沉淀优化
由于特殊医学用途婴儿配方食品基质复杂，考虑蛋白质沉淀是否充分。有研究对比了乙腈、硫酸锌、亚铁氰化钾与乙酸锌的混合试剂沉淀婴幼儿配方奶粉，结果发现亚铁氰化钾与乙酸锌的混合试剂效果最好[25]。现选择3种蛋白质沉淀方法进行比较，乙酸锌和亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白质法，调节pH酸碱变性蛋白沉淀法，磺基水杨酸蛋白质沉淀法。
乙酸锌和亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白质法是利用乙酸锌与亚铁氰化钾反应生成的氰亚铁酸锌沉淀来挟走或吸附干扰物质，这种方法除蛋白质能力强。
酸碱变性沉淀法改变了蛋白质pH环境，蛋白质分子结构从有规则的排列变成不规则排列，其物理性质也发生改变，并失去原有的生理活性，即蛋白质发生变性，变性蛋白质在水中的溶解度较小且以沉淀的形式从溶液中析出。这种方法除蛋白质能力较弱。
磺基水杨酸蛋白质沉淀法是利用生物碱制剂磺基水杨酸在酸性环境下，其阴离子可与带正电荷的蛋白质结合成不溶性蛋白盐而沉淀。这种方法除蛋白质能力稍差，个别样品除蛋白后依然出现浑浊状态。
用3种蛋白质沉淀方法进行实验对比如，图2所示。结果表明用乙酸锌和亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白质后测得的样品中牛磺酸含量更接近其对应标签明示值。
图2 不同沉淀蛋白方式的牛磺酸结果
2.3 样液稀释及衍生优化
沉淀后上清液分别用水进行稀释，得到原样液、5倍稀释液、10倍稀释液、20倍稀释液，进行衍生优化对比。4个浓度待测液按照1.2.4样液稀释、衍生步骤操作。
另取标准曲线工作液用水进行稀释，得到原标准曲线工作液、5倍稀释工作液、10倍稀释工作液、20倍稀释工作液，同时进行上述衍生，得到4条衍生后的标准曲线工作液，供高效液相色谱分析仪检测。
当原样液、5倍稀释液时，得到样品中牛磺酸的含量较低，稀释10倍时样品中牛磺酸的含量较高，接近标签明示值，稀释10倍、20倍时样品中牛磺酸的含量接近。但由于稀释倍数越大误差越大，且目标物在仪器上响应值越低。因此选择10倍稀释液进行实验。不同稀释倍数下牛磺酸的测定结果如表2所示。
表2 不同稀释倍数下牛磺酸的测定结果
2.4 标准曲线线性范围
配制牛磺酸标准系列工作液进HPLC检测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，所得线性回归方程为y=4.427x+1.197，在质量浓度1～50 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数R2=0.999，满足分析要求。牛磺酸标准溶液（10 μg/mL）及特殊医学用途婴儿配方食品中牛磺酸的HPLC图如图3所示。采用逐步稀释法，以基线3倍信噪比对最低检测限进行测定，方法检出限为0.53 mg/100 g；
以基线10倍信噪比对定量限进行测定，方法定量限为1.60 mg/100 g。
图3 牛磺酸标准溶液和样品的HPLC图
2.5 方法回收率和精密度
选取具有代表性的特殊医学用途婴儿配方食品进行回收率与精密度实验，结果如表3所示。添加3个水平浓度牛磺酸标准品。在最优条件下进行样品前处理,同时做空白实验。由表3可知，3个添加水平下加标回收率范围为89.6%～103.9%，精密度（RSD）为0.19%～5.02%。
表3 特殊医学用途婴儿配方食品3水平加标回收率和精密度
（续表3）
2.6 实际样品测定
采用本方法对8批次特殊医学用途婴儿配方食品中牛磺酸的含量进行检测，外标法定量，并与其标签明示值进行比较。由表4可知，本实验方法中牛磺酸含量与其对应标签明示值无显著差异，表明采用本方法测得牛磺酸结果可靠。
表4 部分市售样品牛磺酸含量及其标签明示值
本方法采用乙酸锌和亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白法沉淀蛋白，并将样液稀释10倍后再衍生的柱前衍生前处理方式，用资生堂CAPCELL PAK C18，5 μm，4.6×250 mm色谱柱进行梯度洗脱，建立高效液相色谱仪测定特殊医学用途婴儿食品中牛磺酸含量的检测方法。结果表明：在质量浓度1～50 μg/mL范围内，牛磺酸标准曲线具有良好的线性关系；
该方法的检出限为0.53 mg/100 g，定量限为1.60 mg/100 g；
加标回收率范围为89.6%～103.9%，精密度（RSD）为0.19%～5.02%。本方法灵敏高效、衍生充分、回收率优良、重复性稳定，适用于特殊医学用途婴儿配方食品中牛磺酸的检测。
