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汤睿，魏丹丹，杜芳玲，刘蓬，万腊根，刘洋，王建宁
（南昌大学第一附属医院 1.门诊部；
2.检验科；
3.护理部，江西 南昌 330006）
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KPN)存在于人体肠道和呼吸道内,可引起免疫功能低下患者呼吸道、血液、腹腔及泌尿系统等部位感染[1]。
近年来， 医院KPN 感染率以及耐药率呈明显上升趋势，主要是抗菌药物、免疫抑制剂以及侵入性操作等的广泛运用，2019 年全国细菌耐药监测网数据显示，KPN 是居于第二位的肠杆菌科细菌且呈逐年上升的趋势[2]。
随着碳青霉烯类抗生素的广泛应用，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbepenem- resistant Klebsiella peumoniae, CRKP) 在我国呈现逐年上升趋势[3]。
这类菌株常变现为泛耐药，可选择的治疗药物有限且容易导致感染播散， 给临床感染治疗带来巨大的挑战，严重威胁全球公共卫生。本研究旨在通过回顾性分析南昌大学附属第一医院近5 年的KPN 的分离率、标本分布、科室分布及耐药性变迁，同时使用PCR 方法检测耐药基因，明确其耐药机制，为医院感控管理、临床科学合理抗感染治疗提供依据。
1.1 菌株来源 南昌大学第一附属医院2016 年1月至2020 年12 月分离的KPN。
剔除了同一个患者相同部位的重复菌株， 收集菌株的临床信息和药敏结果。
1.2 主要仪器和试剂 法国梅里埃生物公司的Vitek2 Compact 全自动微生物鉴定药敏分析仪，MH 琼脂购自上海科玛嘉微生物技术有限公司、KB 法补充用药敏纸片购自英国Oxoid 公司、大肠埃希菌ATCC 25922 购自卫生部临检中心。
1.3 细菌鉴定和药敏实验 按照《全国临床检验操作规程》(第3 版)[4]进行细菌培养和分离。
采用Vitek2 Compact 全自动微生物鉴定及药敏仪进行菌株鉴定及其药敏试验，补充药敏用纸片扩散法，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922， 药敏结果根据上一年度最新CLSI M100 标准判读[5]。
1.4 PCR 检测碳青霉烯类耐药基因 煮沸法提取模板DNA。
PCR 方法检测5 种常见的碳青霉烯酶耐药基因 (KPC、NDM、OXA-48、IMP、VIM 基因)，PCR 扩增引物、 体系和扩增条件参照相关文献[6]。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像仪观察结果， 并将阳性扩增产物送上海生工生物有限公司测序比对分析。
1.5 统计学分析 采用WHONET 5.6 软件及SPSS17.0 软件进行统计分析，使用χ2检验进行数据分析。
2.1 菌株信息 2016 年至2020 年期间共分离出6885 株KPN，其中2016 年1225 株（17.79%）、2017年1 282 株（18.62%）、2018 年1 396 株（20.28%）、2019 年1 563 株（22.70%）、2020 年1419 株（20.61%）；
年度检出率从2016 年的10.41%逐渐上升至2020 年的14.17%，见图1。
其中4576 株来自男性患者（66.46%），2309 株来自女性患者（33.54%）。患者年龄为2d～94 岁，1 岁及以下患者占0.60%（41/6 885），60 岁及以上患者占46.87%（3 227/6 885）。
图1 2016 年至2020 年KPN 培养分离率变化趋势
2.2 菌株标本来源及科室分布 6885 株KPN 主要分布于重症监护病房(2846，41.34%)、 神经外科(726，10.54%)、 康 复 科 (428，6.22%%)、 呼 吸 科(298，4.33%)、泌尿外科(295.4.28%)等科室。
标本来源以痰为主 （4328， 62.86%）， 其次 是为 尿液（921，13.38%）、血液（822，11.94%）、伤口分泌物,（248，3.60%）。
2.3 药敏分析和耐药变迁分析
2.3.1 不同年份肺炎克雷伯菌耐药性变化 从近5年耐药变迁上看，除头孢唑啉，头孢呋辛，阿米卡星，复方新诺明和替加环素外，虽然2017 年出现了一个高的拐点， 但对其他常用抗菌药物耐药率仍呈稳步上升趋势，而对于三、四代头孢及其酶抑制剂类复合物， 喹诺酮类和碳青霉烯类抗生素耐药率增长明显。
其中头孢哌酮/舒巴坦，哌拉西林/他唑巴坦， 左旋氧氟沙星和碳青霉烯类抗生素均从30%上升至40%以上， 增高10 个百分点以上。总体而言， 我院KPN 除对阿米卡星和替加环素的耐药率维持在较低水平外， 对其他常见抗菌药物耐药率均较高，特别是2020 年亚胺培南和美罗培南分别高达40.6%和43.1%。
药物敏感实验结果见表1。
表1 2016-2020 年KPN 对常用抗菌药物的耐药变迁
2.3.2 不同科室肺炎克雷伯菌耐药性变化 重症监护病房、神经外科、康复科、呼吸科、泌尿外科是分离菌株数前5 位的科室， 这些科室患者特点差异大， 因此不同科室来源的KPN 对相同抗菌药物的耐药性存在较大差异。
其中康复科耐药率最高，对亚胺培南、 美罗培南的耐药率高达60.4%、61.5%。泌尿外科分离出的KPN 总体对抗菌药物的耐药率最低， ICU、神经外科和康复科亚胺培南、美罗培南耐药率均高于50%。
见表2。
表2 不同科室来源KPN 对常用抗菌药物的耐药率比较
2.3.3 不同标本来源肺炎克雷伯菌耐药性变化 标本来源不同，KPN 对抗菌药物耐药率存在明显差异， 来自伤口分泌物KPN 对抗菌药物耐药率均明显小于其他标本， 来自尿液和无菌体液标本的KPN 则对抗菌药物耐药率常较高于其他标本。
在不同来源的标本中，KPN 都对头孢唑啉耐药率最高，均大于70%，对替加环素耐药率最低，均<5%。对碳青霉烯类抗菌药物的耐药方面， 来自血液的KPN 的耐药率最高，来自伤口分泌物的KPN 的耐药率最低。
见表3。
表3 不同标本来源KPN 对常用抗菌药物的耐药率比较
2.3.4 CRKP 耐药基因分布 对456 株CRKP 耐药基因进行检测， 共检出NDM-1、KPC 以及KPC＋NDM 3 种基因型， 未检出OXA-48， IMP 及VIM基因。其中KPC（342 株）检出率75%，NDM（13 株）检出率2.85%（其中5 株KPC＋NDM），KPC 为我院CRKP 主要携带耐药基因，NDM 携带较少。
KPN 是临床常见的条件致病菌， 在患者免疫力低下以及寄居部位发生移位时，易发生感染。
近年来，随着有创治疗、免疫抑制剂、激素与广谱抗菌药物的广泛使用，KPN 耐药率与分离率均逐年显现上升变化趋势， 特别是CRKP 检出率呈现上升趋势[2-7]，给临床治疗带来极大的难度。
因此，了解KPN 临床分布及耐药变迁， 对临床合理使用抗菌药物、预防和控制院内感染发生、降低患者病死率具有重要的意义。
本研究中显示2016-2020 年我院检出的KPN有所上升，年分离率在10.41%～14.17%之间且呈逐年上升趋势。
标本来源以痰标本为主， 高达62.86%, 这与KPN 易在呼吸道定植更易引起呼吸道感染有关，其次是尿液和血液,与其他地区报道一致[8-10]，在年龄分布中，60 岁以上感染该菌的患者占53.72%，可能免疫力低下、年龄较大、基础疾病较多的患者更易发生感染。
从临床科室的分布来看，以ICU、神经外科和康复科检出较多，这与ICU、神经外科老年患者比重高、病情重、基础情况差和侵入操作等因素有关[11]，而我院康复科主要收治脑梗，瘫痪等长期卧床的病人，常易发生肺部和泌尿道感染。
本研究中KPN 对大部分抗菌药物的耐药率呈明显变化趋势， 5 年间， 虽然2017 年出现了一个小高峰， 但该菌对大多数常用抗菌药物的耐药率仍呈稳步上升的趋势，对三、四代头孢及其酶抑制剂类复合物和喹诺酮类抗菌药物的耐药率较高，均在30%以上且呈上升趋势， 尤其是头孢哌酮/舒巴坦，哌拉西林/他唑巴坦，左旋氧氟沙星均从30%上升至40%以上，增高10%以上，其他地区也有类似报道[8,12-13]，这可能与三代头孢菌素类、氟喹诺酮类作为KPN 治疗一线抗生素高频使用形成的选择压力有关， 且临床医生偏好经验使用孢哌酮/舒巴坦，哌拉西林/他唑巴坦，左旋氧氟沙星、莫西沙星等药物。
值得注意的是我院亚胺培南和美罗培南耐药率从2016 年的32.8%、31.2%上升至2020 年的40.6%和43.1%， 显著高于江西地区平均水平，与我国CRKP 检出率趋势变化相一致[3]。
这可能是这与我院作为江西省最大的省级三甲综合医院，收治危重症感染患者较多、患者住院时间长、基础疾病多，碳青霉烯类抗生素使用频率高有关。
碳青霉烯类药物被认为是治疗耐药革兰阴性菌感染的最后一道防线， 一旦感染CRKP 除治疗难度大外还会增加死亡率。CRKP 最为重要的耐药机制为产碳青霉烯酶[14]，PCR 结果显示产KPC 酶是CRKP的主要机制，其次为NDM，未检测出OXA-48，IMP及VIM 基因。
头孢他啶/阿维巴坦作为一种能新型复合类抗菌药物,能抑制KPC 酶活性，研究[15]推荐其可以和其他抗菌药物联合治疗CRKP, 效果较好，头孢他啶/阿维巴坦联合用药在我院作为“终极武器”抗CRKP 应用前景较大。
此外， 不同标本KPN 对抗菌药物耐药率存在差别， 来自无菌体液及尿液标本的KPN 则对抗菌药物耐药率最高，最低为脓液标本，这可能与送检尿液及无菌体液细菌培养患者侵入性操作多，病情复杂，用药周期长有关。
不同临床科室的患者人群有较大的差异，耐药性也有差别，康复科分离出的KPN 耐药性最强，泌尿外科耐药率最低。除泌尿外科外，ICU、神经外科、康复科、呼吸内科分离的KPN 对碳青霉烯酶类抗生素耐药率均高于40%。可能与以下原因有关：患者本身原发病病情复杂，长期住院、免疫力降低，接受侵入性操作，大量使用广谱抗菌药物[16]。
且ICU、神经外科、呼吸内科分离的KPN 来源于医院获得性肺炎及呼吸机相关性肺炎的比例高于其他科室患者。
值得注意的是2017 年KPN 对β-内酰胺类抗生素的复方制剂、头孢他啶、左旋氧氟沙星、亚胺培南和美罗培南的耐药率出现一个小高峰忽然下降，这与2018 年本院及时采取了一系列有效院感措施有关， 包括成立微生物检验医师病区责任制， 实行点对点合理解读药敏报告单，成立由微生物室、药学部和临床科室的多学科抗感染MDT 团队，实行抗菌药物分级管理制度，提高无菌体液微生物送检文化，同时医院感控处加大对重点人群CRKP 的主动监测力度等， 相关一系列举措都使临床用药更加规范并减少了抗菌药物选择压力。
多重耐药KPN 的出现不仅是临床治疗的难题，也给病人增加了极大的经济负担。
为控制耐药菌传播，应加强抗菌药物的分级管理和应用,提高病原学检查送检率，根据药敏结果及时调整用药，特别是碳青霉烯类抗生素， 同时加强细菌耐药性监测， 根据监测结果指导重点科室如ICU 和神经外科的合理用药，预防和减少多重耐药菌的感染。
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