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陆蒙吉，孙航
（1.杜伊斯堡-埃森大学医学院病毒研究所，北莱茵-威斯特法伦州 埃森，45147；
2.重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所，重庆 400016）
通过普遍接种常规乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）疫苗，乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染在全球大部分地区得到了很好的控制。然而，全球近3亿慢性HBV感染者的健康仍受严重威胁，慢性HBV感染可能发展为肝硬化和（或）肝衰竭及肝癌[1-2]，导致每年多达约90万人死亡[2-5]。
目前，聚乙二醇-干扰素-α（pegylated interferon α，PEG-IFN-α）和核苷（酸）类似物[nucleos(t)ide analogues，NUCs]是 用 于 有 效 治 疗 慢 性HBV感染的抗病毒药物[2,6-8]。基于每日口服NUC的治疗方案的高度安全性，受到慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者的广泛欢迎，并适用于肝硬化、肝衰竭和孕期CHB患者。NUCs可以高效抑制HBV复制，减少HBV相关的终末期肝病和肝癌的发生，然而使用NUC单药治疗的患者很少能够清除HBsAg，并且停止NUC治疗可能会导致急性肝炎发作或肝衰竭，因此，对于大多数慢性HBV感染患者来说，需要进行长期或终身的NUC治疗。PEG-IFN-α治疗可以使10% ～ 30%的病例在明确的治疗时间内实现清除乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）和HBsAg血清转换[6,9-10]。除了直接的抗病毒作用外，IFN-α的免疫调节特性还可诱发针对HBV的特异性免疫控制。然而PEG-IFN-α治疗的耐受性差，常引起严重的不良反应，且需皮下注射，这些因素降低了PEG-IFN-α治疗的成功率。
最近，以HBsAg消失为特征的“功能性治愈”正在成为CHB抗病毒治疗的一个可获得的理想终点[5,11]。“功能性治愈”的基础是持续抑制患者肝脏中共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的活性，导致病毒复制的血清标记消失；
如果免疫机制受到抑制，剩余的cccDNA可能会重新激活，导致慢性肝炎复发，因此，根除cccDNA是治疗慢性HBV感染的最终目标。通过宿主免疫控制HBV感染意味着HBV cccDNA的完全消除或功能失活[12]，尽管其背后的分子机制尚未完全了解，但增强宿主对HBV的免疫力是达到功能性治愈的合理途径。
本文总结了关于利用治疗性疫苗增强适应性免疫力以控制HBV感染的研究，回顾了临床前相关基础研究结果，分析了现有的临床试验结果，对未来的相关研究策略进行了讨论。
导致慢性HBV感染的分子机制尚未完全阐明。比较急性与慢性CHB的免疫反应的特点可见，免疫反应的功能失调是导致HBV持续感染以及肝脏炎症的重要因素[5,13-16]。CHB期间免疫反应的特点是：1）HBV特异性CD4和CD8 T细胞功能障碍和衰竭[17-19]；
2）树突状细胞（dendritic cells，DCs）和自然杀伤细胞（natural killer cells，NKs）/自然杀伤T细胞（natural killer T cells，NKTs）的数量减少且功能失活[13,20-23]；
3）免疫负调节因子上调，包括免疫检查点蛋白程序性死亡受体1（programmed death 1，PD-1）、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、T细胞免疫球蛋白域和黏蛋白域-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，Tim-3）的表达增强[24-26]；
4）先天免疫反应受损，特别是Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）表达下调和功能减退[27-33]。
为了维持平衡，肝脏免疫系统优先诱导对从门静脉进入的抗原的耐受。在CHB中，通过肝脏的免疫耐受机制调节和抑制T细胞功能。研究证实，肝内炎症反应会在肝内诱导多种抑制途径，导致T细胞功能下降[25]。肝脏中的免疫耐受机制对于保护肝脏免受炎症引发的严重损害至关重要，但同时进一步损害了HBV特异性T细胞的功能。
目前的研究结果表明，血清中高HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平是维持慢性HBV感染者的HBV特异性免疫耐受的重要因素。减少外周血以及肝内HBV病毒复制和蛋白表达是建立有效的HBV特异性T细胞反应的前提条件[34-37]。
临床有个例发现，通过采用抗HBsAg阳性供体的骨髓移植可以实现HBV清除[38]，这为通过免疫调节治愈HBV感染提供了一定的途径。肝脏移植也可以将接种过疫苗的供体的免疫细胞转移给受体，可以部分控制肝脏的再感染[39]。越来越多的研究已开展探索包括涉及小分子的治疗策略，以提高患者的HBV免疫力，旨在实现HBV感染的功能性治愈[40-42]。
基于对形成慢性HBV感染的免疫机制的认识，一些新型的策略被用来增强患者的HBV特异性免疫反应。一方面，口服、鼻内或皮下应用病原体识别受体（pattern recognition receptor，PRRs）的激动剂，包括TLR、维甲酸诱导基因1（retinoic acid inducible gene I，RIG-I）和干扰素基因（stimulator of interferon genes，STING）的刺激剂，激活宿主免疫细胞和肝细胞/非肝细胞，诱导IFN的产生以及干扰素刺激基因（interferon stimulated genes，ISG）和促炎症细胞因子的表达，启动细胞的抗病毒状态；
另一方面，用治疗性疫苗诱导HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），通过阻断免疫检查点作用来增强T细胞功能，或转移体外激活的T/NKT细胞或基因编辑的HBV特异性T细胞，如：嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）或T细 胞 受 体（T cell receptor，TCR）-T细胞加强细胞免疫。在过去几年，这些策略的潜在应用价值已得到部分证实，但这些方法投入临床应用仍有许多障碍有待于克服。
2.1 HBsAg/preS疫苗
在临床前动物模型或CHB患者中，传统的HBsAg疫苗作为治疗性疫苗均未能产生明显的治疗效果，这归因于慢性CHB感染的宿主产生了HBsAg特异性免疫耐受。使用白细胞介素12（interleukin 12，IL-12）作 为 佐 剂，HBsAg免疫可有效逆转宿主对HBV蛋白的系统性耐受，增强HBV特异性CD8/CD4 T细胞反应，降低CD4+Foxp3+调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的比例[43]。大多数同时注射IL-12和疫苗的动物清除了血清中的HBsAg，同时乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）在肝细胞中消失。同样，preS1多肽也已被证实能在HBV转基因小鼠中诱导有效的免疫反应，产生抗preS1抗体清除HBV病毒，甚至通过序贯给予preS1和HBsAg疫苗导致HBsAg/HBsAb血清学转换[44]。
2.2 HBcAg疫苗
在能够较好控制HBV复制的CHB病例中，HBcAg特异性CTL的水平明显升高[45]，因此，基于HBcAg的疫苗有望用于CHB免疫治疗。然而，含有HBcAg 18 ～ 27位氨基酸的多肽和含有Th表位的肽基疫苗在CHB患者中仅诱导了低水平的CTL活性，未能清除HBV[46]。据报道由Inovio制药公司设计了一种合成的HBcAg疫苗，可以有效降低肝脏肿瘤的风险[47]，但目前关于这种候选疫苗的信息非常有限。
2.3 HBsAg/HBcAg复合疫苗
由HBsAg和HBcAg及CpG佐剂组成的治疗性疫苗在野生型C57BL/6小鼠和HBV转基因动物模型中能够引起强烈的针对HBsAg/HBcAg特异性体液反应，促进针对HBsAg的Th1/Th2平衡反应，以及针对HBcAg的Th1型反应；
增强的HBsAg/HBcAg特异性细胞免疫反应导致HBV转基因小鼠中的血清HBsAg水平明显降低，但未出现肝脏损伤[48]。由HBsAg、HBcAg和佐剂ISCOMATRIXTM组成的微粒疫苗可以在HBV转基因小鼠中诱导多特异性和多功能T细胞，特别是针对HBcAg的特异性CD8 T细胞，使其γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-2的分泌量升高；
4次疫苗接种后，8只动物中有7只动物的抗HBsAg滴度超过10000 IU · L-1；
接种2次和4次疫苗后，HBV转基因小鼠血清中HBV DNA的滴度下降，但没有达到统计学意义；
HBcAg阳性的肝细胞也急剧减少，但没有出现明显的肝损伤[49]。
2.4 抗HBsAg抗体
抗体介导的免疫疗法已在一些临床前和临床研究中得到评估，但均未能达到长效的HBV抑制作用。Zhang等[50]开发了一种新的抗HBsAg的单克隆抗体（mAb E6F6），在几种小鼠模型中具有显著抑制HBV复制的效果。在HBV转基因动物中，单剂量的mAb E6F6明显且持续减少血清中HBsAg和HBV DNA的载量；
在人肝嵌合小鼠模型中，mAb E6F6不仅可以有效防止原发性HBV感染，还可以减少被HBV感染肝细胞造成的二次传播；
在水动力注射建立的HBV持续复制小鼠中，基于mAb E6F6的免疫治疗能够恢复抗HBV T细胞反应。在mAb E6F6相关的病毒免疫清除中，独立于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cellmediated cytotoxicity，ADCC）和补体介导的细胞毒 性 作 用（complement-dependent cytotoxicity，CDC）的Fcγ受体依赖的吞噬作用发挥了最关键的作用[51]。
2.5 DNA疫苗
编码HBsAg和HBcAg的DNA疫苗可诱导针对这2种HBV抗原的体液及细胞免疫[52-56]。肌肉注射或皮内注射DNA疫苗后，肌细胞和抗原呈递细 胞（antigen-presenting cells，APCs）能 够 摄 取DNA，在原位表达HBsAg和HBcAg，并递呈给宿主免疫细胞，诱导特异性B细胞和T细胞激活[57-58]。在小鼠和土拨鼠乙肝模型的临床前研究中，DNA疫苗获得了有意义的结果。实验中结合了不同的方法来提高DNA疫苗的效力，包括：1）整合免疫刺激细胞因子[59]；
2）与NUCs结合[60-61]；
3）初始/加强（prime/boost）免疫方案[61-62]；
4）DNA疫苗的电穿孔传递[56]；
5）与免疫检查点抑制相结合[63]。
Chuai等[64]使用一个复杂的程序对恒河猴进行疫苗接种，4只动物接受了3剂编码HBsAg、PreS1和HBcAg的DNA疫苗作为初级免疫，然后用编码HBsAg、PreS1和HBcAg的重组病毒载体疫苗进行2次强化，最后用包括HBsAg和PreS1的融合蛋白进行免疫。DNA疫苗接种迅速诱导出抗PreS1抗体，继而出现抗HBsAg和抗HBcAg抗体；
重组病毒载体疫苗接种进一步诱导出针对HBsAg、PreS1和HBcAg的体液和细胞免疫反应，其中以针对HBcAg特异性CTL反应最为强烈和持久；
最后用融合蛋白增强免疫反应，可维持对所有3种HBV抗原的免疫反应，直到第1次接种后的第98周。这些结果表明，融合PreS1和HBcAg可能会提高治疗性疫苗的效果。
2.6 基于病毒载体的疫苗
Kosinska等[61-62]在小鼠和土拨鼠HBV感染模型中测试了基于腺病毒载体的治疗性疫苗，获得了较好的抗病毒效果。Moshkani等[65]设计了一个基于水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）的疫苗平台。通过滴鼻或肌肉注射表达乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白（middle hepatitis B surface antigen，MHB）的高度减毒的VSV株，成功诱导了针对MHB特异性CD8 T细胞和体液反应，免疫后在小鼠模型中能够防止基于腺相关病毒载体重组HBV基因组（AAV-HBV）转导后启动的HBV复制。在HBV持续复制的小鼠模型中，VSV-MHB系统也能诱导明显的多特异性T细胞反应，导致血清和肝脏HBV抗原和DNA水平下降，同时血清丙氨酸转氨酶活性也有短暂的升高。这些实验数据为基于病毒载体的治疗性疫苗的潜在效用提供了证据。
多年来，HBV治疗性疫苗的设计和有效性均得到了改善。在各种实验环境中，这些候选疫苗可刺激HBV特异性T细胞，并达到不同程度的HBV抑制。最有效的疫苗是那些基于病毒载体的疫苗，在T细胞诱导方面优于其他类型疫苗。尽管如此，其他类型疫苗如DNA疫苗可以多次重复应用，并与病毒载体联合使用。目前，候选疫苗的临床前和临床研究还需继续进行，需要解决的主要问题是目前可用的HBV疫苗以及免疫治疗方法是否足够有效。需要克服的障碍在于如何招募和维持活化的免疫细胞进入肝脏，以扩大肝脏内的HBV特异性免疫力。因此，抗病毒治疗和免疫调节药物（包括TLR配体和免疫检查点抑制剂）的组合可能是必要的，以最终产生有效、持久的T细胞免疫力。
许多免疫治疗方法已在不同的动物模型中进行了实验，但只有少数进入了临床试验阶段。需要指出的是，强效抗病毒药物和治疗性DNA与基于病毒载体的疫苗的联合治疗在土拨鼠模型中得到部分成功结果，显示病毒得到完全控制并诱发抗HBsAg抗体，然而，类似的方法在慢性HBV感染患者中却未见效果。
3.1 GS-4774
GS-4774是一种基于酵母菌的重组疫苗，含有HBV特异性抗原，如乙肝病毒x（hepatitis B virus x protein，HBx）蛋白和乙肝表面大蛋白（large HBV surface antigen，LHBsAg）[66]，其安全性、耐受性和免疫原性已在健康受试者中得到验证。然而，在一项Ⅱ期临床研究中，GS-4774用于病毒抑制的CHB患者未显示出临床获益，平均HBsAg水平未见明显下降，高剂量GS-47743组少数患者HBsAg下降了0.5 log10IU·mL-1，但没有HBsAg清除的病例。部分HBeAg阳性者在使用GS-4774后出现HBeAg转阴[67]。
一项针对CHB患者单独使用富马酸替诺福韦酯（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）或联合使用GS-4774的开放标签、多中心、随机研究（NCT02174276）结果已经公布[68]。在第24周和第48周，联合使用GS-4774和TDF后，患者体内针对HBV特异性CD8+T细胞产生IFN-γ、TNF-α和IL-2的能力明显增加，而接受TDF单药治疗的患者中未见这种现象。T细胞功能的增加与Treg数量的减少有关。然而，GS-4774治疗没有降低患者的HBsAg水平，因此，GS-4774能够刺激宿主CD8+T细胞反应，但不足以控制HBV。
3.2 NASVAC
滴鼻型的候选疫苗NASVAC是由HBsAg和HBcAg组成。在Ⅰ期临床试验中，用NASVAC鼻腔喷雾免疫3次30天后可在所有受试者中诱导出抗HBcAg抗体，75%的受试者在接种后90天的最晚观察时间内产生抗HBsAg抗体；
NASVAC肌肉注射后的耐受性也较好，所有14名入组患者均出现针对HBV特异性淋巴细胞增殖反应[69]。在一项Ⅲ期随机对照临床试验中，共有80名CHB患者接受了NASVAC的滴鼻或皮下注射，与PEG-IFN-α治疗相比，NASVAC治疗结束时病毒载量低于检测限的患者比例相似（59.0%vs62.5%，P＞0.05）；
在24周的随访中，有更高比例患者（57.7%vs35.0%）的HBV载量持续低于检测限值[70]。然而，这些结果尚需要进一步临床试验来验证。
3.3 YIC
在一项Ⅱ期临床试验中，HBeAg阳性的CHB患者接受6次HBsAg-抗体免疫复合物（yeast-derived hepatitis B surface antigen-antibody immunogenic complex，YIC）免疫，与只用明矾佐剂的对照组相比，接种YIC后患者HBeAg血清学转换率明显提高（对照组为9%，YIC组为21.8%），病毒载量下降[71-72]。然而，在Ⅲ期临床试验中，接种12次的免疫方案未能显示出令人满意的结果[73]。探索YIC免疫机制的试验（临床注册号：ChiCTR-TRC-11003189）显示，YIC免疫与阿德福韦酯治疗相结合，可以促进CD4和CD8 T细胞反应增加。用YIC免疫的个体中，CD4+T细胞中IFN-γ的产生明显增加，而IL-10、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和Foxp3的表达减少[74]。
3.4 HepTcell
HepTcell是一种由9种合成肽组成的混合物，包括HBV特异性T细胞表位。在英国和韩国进行的Ⅰ期临床试验中，HepTcell用于已接受恩替卡韦或TDF治疗的HBeAg阴性CHB病例，每月3次注射HepTcell的耐受性良好，并能诱导患者产生针对HBV抗原的细胞免疫反应[75]。Ⅱ期临床试验计划在更大的受试群体中，通过增加注射次数进一步评估HepTcell的免疫和治疗效果。
3.5 DNA疫苗
目前，一些基于DNA的HBV疫苗的临床研究仍在进行。在法国早期的Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，治疗性DNA疫苗已被证实在CHB患者中的安全性[76-77]。然而，即使与NUCs联合使用，DNA疫苗也没有获得令人满意的结果，只在患者中引起短暂微弱的T细胞反应，NK细胞增加，没有持续的病毒学应答。在接受拉米夫定治疗的HBV携带者中，含有大部分HBV基因的DNA疫苗联合IL-12表达，可以诱导针对HBV特异性的IFN-γ分泌T细胞，治疗后的免疫效应维持40周或更长时间，并与病毒学反应相关[78]。一种携带HBsAg、HBcAg和聚合酶的非复制性腺病毒载体疫苗（TG1050），在小鼠模型中能够诱导出强烈的针对HBV多特异性和长时间的T细胞反应[79]。在CHB患者中进行的Ⅰb期研究，证实了TG1050的安全性和免疫原性，有望未来与抗病毒药物联合使用[80]。
慢性HBV感染被认为是针对HBV特异性免疫耐受的结果。打破免疫耐受并恢复HBV特异性免疫反应可能最终使得患者能够控制和清除HBV。目前，诱导针对HBV特异性免疫反应是可行的，但在慢性HBV感染患者中并没有达到控制HBV的效果。这些并不理想的结果可能有不同的原因。在免疫转移的实验中，将大量活化的CD8+T细胞转移到HBV 转基因小鼠中，只能短暂抑制HBV复制[81]。在另一实验中，将HBsAg接种小鼠的脾细胞转移到HBsAg转基因小鼠体内，可持续产生抗HBsAg抗体，并在受体小鼠的外周血中清除HBsAg[82]。然而，HBsAg特异性CD8+T细胞则无法检测，受体肝脏中的HBsAg继续产生。重要的是，在转基因小鼠的肝脏中未观察到炎症和T细胞浸润。此外，在水动力注射后HBV持续复制的小鼠中可检测到针对HBV特异性T细胞，但这些T细胞未进入肝脏。通过TLR3刺激引发肝内免疫激活，可诱导T细胞进入肝脏组织[83]。最近的报告也显示，在免疫耐受期的年轻CHB患者的外周血中可检测到HBV特异性T细胞[84]。研究发现这些针对HBV特异性T细胞具有增殖和产生细胞因子的能力[85]。所有这些实验体系中的特异性CD8+T细胞显然不能阻断慢性肝脏炎症的进展[86]。因此，HBV特异性T细胞的抗病毒作用可能需要在适当条件下被募集到肝脏进而发挥抗病毒作用。TLR激动剂可能有助于促进肝脏中的T细胞功能[83,87-88]，通过募集各种免疫细胞进入肝脏，形成三级淋巴结构[89-91]。这几个方面的问题已有研究进行讨论，但仍需要在未来的研究中进行验证[30,32-33,41]。
宿主免疫反应对控制HBV感染具有重要意义，但慢性HBV感染的成功治疗可能需要结合NUCs的抗病毒治疗，激活肝内先天免疫，刺激特异性T细胞反应，最后开启非免疫机制，以实现持续的HBV控制而不产生不必要的副作用。最近的研究结果指出，肝细胞中的cccDNA和（或）整合的HBV DNA的存在影响慢性HBV感染的“功能性治愈”。在肝细胞中仍存在cccDNA或整合HBV DNA的情况下，尚不清楚仅靠HBsAg血清转换/清除是否能防止肝细胞癌（hepatic cell cancer，HCC）发生。免疫疗法至少可清除大部分带有cccDNA和（或）整合了HBV DNA，持续表达HBV蛋白的肝细胞，从而降低HCC发展的风险。
最近，诱导抗原特异性T细胞的技术已在研发中，这是一个快速发展的研究领域，有可能应用于慢性病毒感染的治疗上。HBV特异性T细胞可通过DC疫苗诱导，或通过免疫检查点阻断进行增强，或通过实验室生产的HBV特异性T细胞如CAR-T和TCR-T细胞，转移给慢性HBV感染患者用于治疗[92]。
虽然基于DC和细胞因子诱导的杀伤细胞联合（DC-cytokine induced killers，DC-CIK）的细胞免疫治疗在中国已应用于患者，但迄今为止，已有的临床数据尚未进行系统分析。对接受DC-CIK治疗的患者进行随访并确定这种方法的实际效用是很重要的。T细胞的肿瘤治疗的最新进展为HIV和HBV等主要慢性病毒感染提供了指导。与肿瘤治疗不同，抗病毒治疗的安全性问题更为严格，任何不受控制的、过度免疫反应在患者身上产生的风险均是不可接受的。同样，免疫检查点抑制剂的应用也面临类似挑战，需要在增强宿主免疫反应和控制不良免疫病理风险之间取得平衡。
虽然迄今为止进入临床试验评估的治疗性疫苗大都未能取得理想的病毒抑制效果，降低了人们对免疫疗法的希望。然而，这些研究中的负面结果并不令人惊讶，因为治疗性免疫调节不是简单地诱导适应性免疫，而是需要通过克服慢性病毒感染期间建立的强大的免疫负调节功能，才能获得长期的治疗效果。在接受抗病毒治疗已经有效抑制HBV复制的患者群中继续尝试这些方法是很重要的，这类患者的免疫系统可能有一定程度的恢复，并对免疫刺激作出更有力的反应；
有一些患者的HBV负荷持续较低，提示可能对HBV感染的免疫控制自然增强，在未来的临床试验中考虑选择这类患者可能更有效。
目前正在探索新的免疫调节方法，包括检查点抑制剂、T细胞的代谢调节、治疗性疫苗、基因工程T细胞的过继转移以及刺激先天免疫和B细胞免疫反应。根据病毒学和疾病特征，这些新方法可以进一步互相之间或者与抗病毒治疗进行各种组合，以个性化策略，最大限度地提高HBV治愈的机会。尽管临床发展面临持续的挑战和挫折，但通过治疗性疫苗接种与其他形式的免疫治疗方法相结合在HBV治愈的道路上仍然存在希望。
利益冲突：作者没有利益冲突需要声明。
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