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李宁宁，孙 韬，雷延飞，李晓英，马香芹，杨 亮
(河南医学高等专科学校a.基础医学部；
b.医学系；
c.检验系，郑州 451191)
顺铂(cisplatin,CP)作为第一代铂类药物，是治疗非小细胞肺癌等实体瘤和血液系统肿瘤最常用的一线、广谱化疗药,但其临床试验报道的不良反应也较多，如电解质紊乱、骨髓毒性、神经毒性、溶血性贫血、耳毒性、肾毒性等，尤其是肾毒性[1-2],单用CP化疗所致肾损伤的发生率为25%～30%[3],严重限制其临床应用。具有高发病率和高病死率的急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是CP肾毒性的主要特征之一[4]。尽管目前在使用铂类药物的同时通常会采取相应的预防措施，但仍然会有4%～23%的患者因使用铂类药物而发生AKI，使其临床应用常常受到限制,但其确切作用机制至今仍不完全清楚[4]。褪黑素是松果体的分泌产物，参与调节多种生理功能，包括抗氧化、抗癌、抗炎、抑制肾内肾素-血管紧张素系统(RAS)激活、保护肾功能等[5-6]。本实验通过建立CP诱导的AKI小鼠模型，探讨褪黑素对小鼠肾脏的影响及其机制，为临床预防CP诱导的肾毒性提供实验依据。
1.1 材料
1.1.1 实验动物 6周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠40只，体质量20～25 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(鲁)20190003。小鼠每日给予充足的水和饲料，温度(23±1)℃，相对湿度50%～60%，光照和黑暗各12 h，适应性饲养1周后开始实验。动物实验通过河南医学高等专科学校医学伦理委员会审查批准(审查编号：HNYZLLWYH-2021-001)，动物饲养及动物实验方案均严格按照动物福利伦理委员会实验动物规范进行。
1.1.2 药物、试剂和仪器 CP和褪黑激素购自Sigma Aldrich公司(St.Louis,MO,USA)。Ki67、MPO试剂盒均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，RM2016)，正置光学显微镜(日本尼康，Nikon Eclipse E100)。
1.2 方法
1.2.1 动物分组、造模 将40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组(Control组)、模型组(Cisplatin组)、治疗组(Cis+Mel组)及褪黑素组(Mel组)，每组10只。Control组按20 mL·kg-1腹腔注射生理盐水；
Cisplatin组和Cis+Mel组：将CP溶解于无菌生理盐水中，以15 mg·kg-1一次性腹腔注射的方法建立AKI小鼠模型；
Cis+Mel组：将褪黑素溶解于生理盐水中，以20 mg·kg-1在CP注射2 h后腹腔注射褪黑素，每日1次，连续注射3 d；
Mel组以20 mg·kg-1一次性腹腔注射褪黑素。每日观察小鼠的精神状态，记录给药前体质量。Control组注射生理盐水72 h后，Cisplatin组注射CP 72 h后，Cis+Mel组最后一次注射褪黑素24 h后，Mel组注射褪黑素72 h后，造模工作结束。
1.2.2 苏木精-伊红(HE)染色 实验结束后，腹腔注射质量分数1%戊巴比妥钠(50 mg·kg-1)麻醉小鼠，迅速取小鼠左侧肾脏，用质量分数4%多聚甲醛溶液固定，依次经过脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，5 μm厚度的组织切片。切片经HE染色后，使用配备徕卡成像系统的软件显微镜扫描，观察肾组织的病理学变化。
1.2.3 肾脏组织Ki67、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)蛋白表达的检测 免疫组化法：常规梯度酒精脱水和二甲苯透明后，加入一抗(1∶100稀释)，置于4 ℃冰箱中过夜，滴加生物素标记的二抗孵育(37 ℃，10 min)，再滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液(37 ℃，10 min)，苏木精复染，中性树胶封片，显微镜下观察。
2.1 褪黑素对CP诱导的AKI小鼠体质量的影响
与Control组比较，Cisplatin组、Cis+Mel组小鼠体质量下降，差异有统计学意义(P<0.001)，Mel组小鼠体质量改变差异无统计学意义(P>0.05)；
与Cisplatin组比较，Cis+Mel组小鼠体质量改变差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 褪黑素对顺铂诱导的AKI小鼠体质量的影响
2.2 褪黑素对CP诱导的AKI小鼠肾组织病理变化的影响 Control组肾组织中肾小管、肾小球结构正常，无变性和坏死等病理改变；
Cisplatin组小鼠肾组织部分肾小管上皮细胞脂肪变性，细胞内脂滴较多，部分肾小管上皮细胞核浓缩、溶解，甚至死亡、脱落；
肾小球充血肿胀，并可见大量白细胞浸润；
与Cisplatin组比较，Cis+Mel组小鼠肾脏小管上皮细胞虽有少量细胞核发生浓缩，但坏死数量显著减少，肾小球内充血水肿、白细胞浸润现象减轻；
Mel组小鼠肾脏无明显病理损伤改变。见图1。
图1 褪黑素对CP诱导的AKI小鼠肾组织病理变化的影响(10×20)
2.3 褪黑素对CP诱导的AKI小鼠肾组织中Ki67蛋白表达的影响 免疫组织化学染色结果显示，Cisplatin组小鼠肾髓质可见肾小管上皮细胞死亡、脱落，肾小管上皮细胞核内Ki67表达阳性。与Control组比较，Cisplatin组肾小管上皮细胞中Ki67蛋白表达阳性细胞数显著增多(P<0.001)；
与Cisplatin组比较，Cis+Mel组肾小管上皮细胞中Ki67蛋白表达阳性细胞数减少(P<0.05)。见图2。
注：**:与Control组比较，P<0.001；
#:与Cisplatin组比较，P<0.05。
2.4 褪黑素对CP诱导的AKI小鼠肾组织细胞中MPO蛋白表达的影响 与Control组比较，Cisplatin组小鼠肾组织MPO蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.001)；
与Cisplatin组比较，Cis+Mel组小鼠肾组织中MPO蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。
注：**:与Control组比较，P<0.001；
#:与Cisplatin组比较，P<0.05。
AKI是由多种病因引起的致死率较高的一种临床综合征，是危重症疾病最常见的并发症之一，发病率和致死率极高，每年均占用高昂的医疗费用，成为全世界需要共同面对与亟待解决的公众健康问题[7]。近年来随着复杂疾病的出现和广泛联合用药，存在着药物滥用问题，使药物引起的急慢性肾功能衰竭患者日益增多，成为导致AKI的重要病因之一[8]。尽管一些药物具有肾毒性，但在临床上的使用仍然是不可避免的。有研究[9]报道，抗生素和抗肿瘤药物对肾脏都有严重的毒副作用，在临床药物性肾损伤病例中，CP引起的AKI所占比例较大。BUSARI等[10]研究发现，CP化疗患者并发肾损伤的人数超过20%，严重限制了CP的临床应用。因此，防治CP化疗所致的肾损伤是临床亟待解决的问题，研发能保护CP诱导AKI的药物至关重要。
褪黑素是由松果体分泌的一种重要的生物调节激素，在生物节律调节等方面具有重要作用。有研究[11-12]发现，褪黑素可改善大鼠体内高水平氧化应激状态，达到控制炎症反应的作用，但褪黑素对CP诱导的AKI的保护作用机制目前尚不清楚。本研究结果显示，在注射CP 2 h后给予褪黑素干预的小鼠肾脏的病理损伤与Cisplatin组小鼠相比明显减轻，体质量升高，说明褪黑素对CP诱导的AKI具有一定的保护作用。
Ki67是一种DNA 结合蛋白，在静止细胞中不表达，但在整个细胞周期中，除G0期外，在细胞核均可以表达Ki67，现在已被广泛应用于标记细胞的增殖指数[13]。近年来Ki67被广泛应用于检测各种肿瘤的增殖活性，如胃癌、乳腺癌等，而抑制Ki67的表达可改善患者的预后[14-15]。肾小管上皮细胞具有显著的自我修复能力，通过增殖细胞代替丢失的细胞，Ki67被作为AKI后肾小管再生和肾修复的标志[16]，但值得注意的是，严重的AKI可能导致不完全修复，管状细胞中Ki67表达的持续增加会导致AKI向慢性肾脏病过度[17]。杨锐等[18]研究发现，活性维生素D3可通过降低人肾小球系膜细胞核Ki67抗原和mRNA的表达发挥保护肾脏的作用。本研究结果显示，Cisplatin组小鼠肾脏部分肾小管上皮细胞坏死、脱落，肾小管上皮细胞中Ki67阳性细胞显著增加，说明肾小管上皮在损伤的同时出现修复现象，但经褪黑素处理后的Cis+Mel组小鼠肾脏肾小管、肾小球损伤明显减轻，肾小管上皮细胞中Ki67阳性细胞减少，提示褪黑素对CP引起的AKI小鼠的肾脏具有保护作用。
CP诱导的AKI机制是多元化的，一般包括炎症、氧化应激和凋亡[19]。MPO是中性粒细胞聚集的特征性酶，通过对MPO表达的测定可以准确反映中性粒细胞的聚集程度，而中性粒细胞是参与炎症反应的主要细胞之一，因此MPO表达水平在一定程度上可以代表组织的炎症程度[20-21]。MPO也是过氧化物还原反应所需的酶，是氧化应激反应的重要标记物，在一定程度上可反映组织的氧化应激水平[22]。氧化应激是氧化和还原反应之间的失衡，导致活性氧(ROS)产生所致[23]。本研究中CP腹腔注射72 h后肾组织中MPO蛋白与Control组比较，表达水平增高明显，但注射CP后给予褪黑素干预后的Cis+Mel组与Cisplatin组比较，MPO蛋白表达明显降低，该结果提示CP诱导的肾损伤可能与白细胞聚集引起炎症反应有关，褪黑素可以通过降低肾组织MPO蛋白活性减轻肾脏炎症损伤程度。
综上所述，褪黑素对CP诱导的AKI具有保护作用，其机制可能与降低肾组织中Ki67、MPO蛋白表达，减轻炎症反应和限制过度增殖有关。
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