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李泽桦 曾宇宏 冯丽芸 阙冬冬 颜竞
南方医科大学珠江医院（广州 510280）
在全球范围内，心血管疾病比任何其他单一疾病造成的死亡人数更多。心肌梗死（myocardial infarction，MI）是指由冠状动脉粥样硬化斑块破裂，形成血栓堵塞引起的局部心肌急性缺血。心梗后心肌代偿性肥大导致左心室重塑甚至进一步恶化成心力衰竭的不可逆病变，是发病率和死亡率最高的心血管疾病之一[1-2]。MI的发病机制复杂，既往研究[3]表明其主要与炎症、氧化应激、凋亡等密切相关。免疫系统的激活与MI后的炎症反应密切相关，其中，巨噬细胞是MI后的主要应答细胞，参与MI后多个环节的调节[4]。巨噬细胞具有功能可塑性，可极化成M1型和M2型两种具有不同免疫功能的活化模式。M1型巨噬细胞可产生促炎因子（如TNF-α、IL-6、INOS），M2型巨噬细胞可产生抑炎因子（如CD206、IL-10、TGF-β），M1型巨噬细胞极化促进MI后心肌细胞损伤，而M2巨噬细胞极化则可抑制MI后心肌细胞损伤，在MI的发生发展中发挥重要作用[5-6]。肠道菌群代谢产物氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）通过炎症反应参与多种心血管疾病的发生发展[7-8]。高水平的血浆TMAO是MI患者的心血管事件死亡风险的独立危险因素[9]。近期有研究[10]显示，TMAO能够激活巨噬细胞介导的免疫反应，诱导巨噬细胞向M1型极化，并使促炎因子分泌增多，在炎症反应中发挥重要作用。本研究通过体内外实验，探索TMAO对MI后心室重构的作用及机制。
1.1 材料
1.1.1 主要试剂戊巴比妥钠（Sigma），TMAO（Sigma），d9-TMAO（Sigma），小鼠CK-MB Elisa试剂盒（默沙克），小鼠cTnT Elisa试剂盒（默沙克），小鼠NT-proBNP Elisa试剂盒（默沙克），小鼠TNF-α Elisa试剂盒（默沙克），小鼠IL-6 Elisa试剂盒（默沙克），WGA（Thermo Fisher Scientific），TUNEL试剂盒（Thermo Fisher Scientific），MYH6一抗（Abcam），CX43一抗（Abcam），羊抗兔IgG二抗（Bioworld），羊抗鼠IgG二抗（Bioworld）。
1.1.2 实验动物与分组雄性6～8周龄C57BL/6（体质量20～25 g），购于南方医科大学实验动物中心。普通饲料和高胆碱饲料（1.2%）均购于广东省医学实验动物中心。所有小鼠均饲养于SPF级动物房中，饲养期间常规饮水，Sham组和MI组喂食普通饲料，TMAO组喂养高胆碱饲料，每组各25只小鼠。
1.2 方法
1.2.1 小鼠MI模型的建立参照既往动物造模方法，结扎小鼠冠状动脉左前降支构建MI模型[11]。腹腔注射1.5%的戊巴比妥钠（0.5 mL/mg）将小鼠麻醉后，进行备皮、固定和气管插管，并将呼吸机的频率设为110 bpm。打开胸腔，在小鼠心脏左心耳下方2 mm处用8-0号线结扎冠状动脉前降支。Sham组只打开胸腔而不进行结扎。
1.2.2 TMAO检测采集所有小鼠的血浆，加入含有内标d9-TMAO（1 mmol/L）的甲醇沉淀蛋白。离心（4℃，15 000g/min）15 min后取上清，采用稳定同位素稀释液相色谱质谱联用技术（LC-MS）进行检测。所有TMAO色谱数据均按照峰面积由Aglient提供的化学工作站计算所得。
1.2.3 心功能检查各组小鼠经2%异氟烷麻醉后，仰卧位固定在VisualSonicsVevo 2100加热板电极上，去除胸前区皮毛并在左心室短轴断面进行左心室乳头肌水平M型超声心动图检测，记录以下参数：左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）。
1.2.4 心肌酶谱、心衰指标和炎症指标检测各组小鼠经眼眶静脉丛取血，4℃低温静置2 h后，3 000 r/min离心15 min取上清。按照ELISA试剂盒说明书检测小鼠血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白T（cTnT）、N端前脑钠素（NT-proBNP）、白介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平。
1.2.5 心肌组织病理改变观察取各组小鼠心脏置入4%多聚甲醛中固定24 h后行常规石蜡包埋和连续切片。所获心脏切片分别行Masson染色观察心肌纤维化程度；
WGA荧光染色观察心肌细胞大小；
TUNEL染色观察心肌细胞凋亡坏死程度，最后置于显微镜下拍摄。
1.2.6 免疫荧光染色取各组小鼠的心脏组织进行冰冻切片，经历固定、抗原修复、血清封闭之后，分别加入Myh6一抗、Cx43一抗和对应的荧光二抗，DAPI染核后封片。最后置于激光扫描共聚焦显微镜下拍摄。
1.2.7 RT-qPCR检测收集各组小鼠心脏组织，用TRIzol法提取梗死周边区心肌细胞的总RNA。采用TaKaRa试剂盒，按照试剂说明书方法将RNA逆转为cDNA，然后用SYBR green试剂配成20 μL的反应体系，置入ABI7500荧光定量PCR仪上进行RT-qPCR反应。最后，以GAPDH作为内参基因，以△△Ct法计算M1型巨噬细胞标志物TNF-α、IL-6、INOS及M2型巨噬细胞标志物CD206、IL-10和TGF-β的mRNA表达水平。所用引物见表1。
表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequence for RT-qPCR
1.2.8 统计学方法所有数据采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料用（）表示。三组间差异使用单因素方差分析，满足方差齐性的用Tukey检验，不满足方差齐性的则采用Dunnett-t3检验，P＜0.05代表差异具有统计学意义。
2.1 TMAO促进MI小鼠心肌损伤构建小鼠MI模型，并在术后喂食含有1.2%胆碱的高胆碱饮食21 d（图1A）。LC-MS结果提示，TMAO组小鼠的血清TMAO水平显著升高，提示高胆碱饮食干预有效（图1B）。同时，血清心肌酶谱检测结果表明，TMAO促进MI小鼠心肌酶CK-MB及cTnT增加（图1C、D）。Masson染色结果表示，与MI组相比，TMAO组心肌梗死面积明显增加（图1E）。通过组织TUNEL染色检测心肌组织细胞凋亡水平，如图1F所示，MI组小鼠TUNEL阳性细胞的比例相较于Sham组有显著增加，MI+TMAO组TUNEL阳性细胞的比例对比MI组更高，提示TMAO能显著促进心梗后心肌细胞凋亡。以上结果表明TMAO可加重MI小鼠心肌损伤。
肠道菌群及其代谢物TMAO与动脉粥样硬化、心力衰竭、高血压和心律失常等多种心血管疾病的发生发展密切相关[7-8，19]。既往的研究也发现TMAO促进血管钙化、心肌肥大的发生发展[20-23]。临床研究表明，高水平的血浆TMAO是MI患者的心血管事件死亡风险的独立危险因素[9]。
2.2 TMAO促进小鼠MI后心室重构心脏彩超结果显示，与Sham组比较，MI组小鼠LVESD、LVEDD均显著升高，LVEF、LVFS均显著降低；
与MI组比较，TMAO组小鼠LVESD、LVEDD升高，LVEF、LVFS降低（图2A、B），提示TMAO促进小鼠MI后心功能障碍。WGA染色同样证实TMAO促进MI小鼠的心肌肥大程度。见图2C、D，与MI组比，MI+TMAO组的心肌细胞面积明显增大。血清NT-proBNP结果表明，TMAO可加剧MI小鼠心室重构后心衰（图2E）。以上结果表明TMAO可加重小鼠MI心室重构。
2.3 TMAO对MI小鼠心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43表达的影响Cx43表达高低可以判断细胞与细胞之间的连接完整性。Myh6蛋白特异性表达于心肌细胞，对心脏切片进行Myh6染色可以区分心肌细胞与其他细胞。见图3，MI组和TMAO组小鼠Myh6蛋白排列紊乱，部分消失。Cx43在正常心肌组织中（Sham组）中广泛表达，而在MI组小鼠心肌组织中表达下降，而MI+TMAO组Cx43表达比MI组显著下降。以上结果提示TMAO使MI后Cx43的表达显著下降，从而减少心肌细胞之间的缝隙连接，说明TMAO破坏心肌细胞间的完整性。
2.4 TMAO促进小鼠MI后心肌炎症反应ELISA检测各组小鼠血清炎症因子水平，相较于Sham组，MI组血清IL-6和TNF-α水平升高；
相较于MI组，MI+TMAO组血清IL-6和TNF-α水平降低（图4A、B）。与 Sham组相比，MI组TNF-α、IL-6、INOS、CD206、IL-10、TGF-β相对表达量明显升高；
与MI组比较，TMAO组M1巨噬细胞标志物TNF-α、IL-6、INOS的mRNA表达水平显著升高，而M2巨噬细胞标志物CD206、IL-10、TGF-β相对表达量显著降低（图4C-H）。以上结果提示TMAO能显著诱导MI小鼠M1型巨噬细胞极化，促进炎症反应。
近年来，MI的发病率和致死率仍处于上升阶段，是威胁国民身体健康的重要因素[11-12]。然而，即使控制MI的相关危险因素，目前对MI后心室重构的防治尚无太多的方法，减轻心肌损伤及改善心功能一直是MI研究的重点难点。研究[13-14]表明，免疫系统在MI炎症反应始动阶段到后期纤维化重塑阶段起重要的调控作用。为了应对MI后心肌细胞死亡和基质降解，促炎阶段和抗炎阶段都是心肌愈合所必需的。在炎症早期，促炎因子诱导巨噬细胞向M1型转化，并进一步引起各类促炎因子的大量释放，主导吞噬损伤部位的凋亡和坏死心肌细胞；
而在炎症消退期间，巨噬细胞向M2型转化并释放大量抗炎因子，这些抗炎因子又进一步促进M2型巨噬细胞的形成，促进心肌组织修复[15]。其中，促炎阶段的持续时间和程度对梗死面积大小和心室重塑具有关键影响，因此，MI疾病过程中巨噬细胞M1表型早期转变为M2型对心功能具有显著的改善作用[16-18]。
目前的研究表明，TMAO能够激活巨噬细胞介导的免疫反应。例如，TMAO可诱导骨髓来源巨噬细胞中的M1极化，从而加重肾纤维化的严重程度[24]。同时，在动物实验中，TMAO通过诱导小鼠M1型巨噬细胞极化加重同种异体移植物抗宿主疾病[10]。反之，抑制TMAO可促进巨噬细胞M2极化，从而增强了颈动脉粥样硬化斑块的稳定性[25]。然而，关于TMAO是否通过促进MI后巨噬细胞极化参与心肌损伤的机制研究却鲜少报道。本研究通过高胆碱饮食诱导MI小鼠血浆中TMAO形成。伴随着TMAO水平升高，MI小鼠心肌组织的损伤及心室重构显著恶化。然而，TMAO能否在MI过程中对M1型巨噬细胞的极化产生作用还不完全清楚。为了进一步验证，从梗死区周围组织提取mRNA进行体外实验。经RT-qPCR检测发现，术后21 d，小鼠心肌梗死周边区组织的M1型巨噬细胞标志物IL-6、TNF-α和INOS和M2型巨噬细胞标志物CD206、IL-10和TGF-β的mRNA表达水平均高于Sham组，提示MI小鼠心肌存在明显的巨噬细胞浸润；
TMAO组小鼠梗死区周围组织M1型巨噬细胞标志物IL-6、TNF-α和INOS的mRNA水平显著高于MI组，反之，M2型巨噬细胞标志物CD206、IL-10和TGF-β的mRNA水平显著降低，提示TMAO的干预可能对心肌梗死区浸润的巨噬细胞向M1型转化起促进作用，令心肌梗死后的炎症反应加剧。
随着巨噬细胞极化和心肌梗死相关研究的深入，基于巨噬细胞调控炎症防治急性心肌梗死的策略越来越受到广泛的重视。本研究发现肠道菌群代谢产物TMAO通过调节M1型巨噬细胞极化可加重心肌组织炎症反应及MI后心室重构，具有一定的临床意义，但TMAO调控巨噬细胞极化的多效性及其在MI转归和预后的具体作用机制尚未明确，仍需进行更深入的探究。
综上所述，TMAO通过诱导M1巨噬细胞极化，加重炎症反应，促进MI后心肌损伤及心室重构。减少高胆碱饮食摄入，以及靶向抑制体内TMAO生成，可能对提升MI患者的预后提供新的思路。
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