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杨 再 ,张玉丹 ,穆鑫 ,裴美丽 ,高媛 ,范雅娟 ,赵斌斌,马现仓
(1.西安交通大学第一附属医院精神心理卫生科,陕西西安 710061;2.西安交通大学第一附属医院转化医学中心,陕西西安 710061;3.西安交通大学附属西北妇女儿童医院生殖中心,陕西西安 710061;4.西安交通大学第一附属医院妇产科,陕西西安 710061)
产后抑郁(postpartum depression,PPD)是指产妇在分娩之后出现的以情绪持续性低落为基础特征的一组精神障碍,是分娩最常见的并发症[1]。PPD不仅会影响产妇的自身健康,而且对婴幼儿的生长发育和情绪行为等也会产生不良影响[2]。目前研究认为,PPD 主要是由于产妇激素改变、遗传以及生产环境等因素引起的[3]。PPD 症的治疗主要包括心理干预和抗抑郁药物,但是心理干预在预防PPD 症的有效性方面缺乏明确的证据[4],而因药物可能对婴儿的影响[5]。因此,探索PPD 的机制,为PPD 提供新的治疗方向是临床亟需解决的问题。
人体的肠道微生物含量巨大且复杂,主要参与宿主的营养吸收、代谢、免疫及炎症反应,维持肠道内环境稳态等,在人体新陈代谢以及生理机能中发挥着重要作用。有研究提示,肠道菌群参与多种疾病的发生与发展过程[6-9]。有研究发现,抑郁症患者Bacteroidetes、Proteobacteria和Actinobacteria的相对丰度显著增加,并且Faecalibacterium与抑郁症状的严重程度呈负相关[10]。关于中国深圳地区的产妇肠道菌群研究表明,PPD 患者的β多样性较高,Enterococcaceae和Escherichia-Shigella出现过度增长[11]。但是肠道微生物的多样性主要受宿主种群、所处地理环境和生活方式的影响。因此,本研究通过对中国西北地区产妇的肠道菌群进行分析,初步探讨肠道菌群与PPD 发生发展中的关系。
1.1 研究对象
选取2021年2月至12月于西安交通大学第一附属医院和西北妇女儿童医院妇产科进行产后复查的产妇60名。本研究经西安交通大学医学部第一附属医院伦理委员会批准,伦理批件号:XJTU1AF2021LSK-002。所有受试者入组前均自愿签署知情同意书。
1.2 纳入标准和排除标准
纳入标准:20岁≤年龄＜45岁的女性;已婚、产后3个月内复查;能有效沟通、能完成量表评估;饮食结构评估大体一致,自愿参加并签署书面知情同意书。
排除标准:患有严重的精神疾病或有精神疾病家族史;曾有抑郁病史者;患有严重的器质性病变者;患有糖尿病、胃肠道疾病等慢性疾病,挑食患者。
1.3 方法
1.3.1 一般资料的采集 所有受试者在入组当天详细询问病史,并进行体格检查及精神检查,收集临床资料,包括年龄、身高、体质量、产后天数、分娩方式和爱丁堡PPD 量表(EPDS)评分。本研究参考Carolina de Vargas Nunes Coll[12]等的方式,主要用EPDS量表来筛查PPD,主要评估的是PPD 症状,有部分入组对象并不能达到抑郁症的诊断标准,所以未用精神疾病的诊断标准。将EPDS≥13 的入组为PPD 组(PPD 组),EPDS＜13 的入组为产后健康对照组(PPHC组)[13]。
1.3.2 粪便标本的采集 入组当天给每位受试者分发专门用于粪便DNA 保存的无菌粪便采集套装,并告知每位受试者粪便采集套装的使用方法,于第2天清晨采集粪便样本。所有受试者采集新鲜粪便标本约5 g于5 mL无菌采集管内,并尽快转移到实验室置于-80℃冰箱保存。
1.3.3 粪便中基因组DNA 的提取 粪便采集后1周内使用DNA提取试剂盒(OMAGE,D4015)进行基因组DNA的提取。先将含有粪便保存液的粪便进行离心,弃去上清,取200 mg沉淀并根据试剂商的说明进行DNA的提取。用核酸定量分析仪进行DNA 浓度以及纯度的检测,并用琼脂糖凝胶电泳进行DNA 完整性检测,将检测合格的DNA保存于-20℃冰箱备用。
1.3.4 16S r DNA 扩增子测序及生物学分析 将粪便标本中提取的16S r RNA 基因,在北京百迈客生物科技有限公司进行测序,即根据保守区(V3+V4区)设计上游引物 338F:5"-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3",下游引物806R:5"-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3",在引物末端加上测序接头,进行PCR 扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库并质检,合格的文库用Illumina Novaseq 6000进行测序。测序数据通过拼接、过滤、聚类,获得OTU 数据。以Silva为参考数据库,使用比对的方法对特征序列进行分类学注释,可得到每个特征对应的物种分类信息,进而在门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)、种(species)水平统计各样品群落组成,利用QIIME 软件生成不同分类水平上的物种丰度表。
1.4 统计学分析
使用R4.0.0 进行统计学分析。计量资料以ˉx±s描述,符合正态分布的计量资料采用两独立样本t检验,不符合正态分布的计量资料采用Wilcoxon秩和检验进行分析。组间计数资料分析采用χ2检验。α多样性采用Wilcoxon 秩和检验,β 多样性采用PERM ANOVA 检验和unweighted unifrac 的PCo A 分析。采用RDA 线性模型的多元直接梯度分析反映抑郁症状评分与肠道菌群的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 研究对象的一般资料
共纳入PPD 组样本30例,PPHC组样本30例。两组之间的年龄、体质量指数(BMI)、产后时间、分娩方式等方面的差异无统计学意义(P＞0.05,表1)。
表1 两组研究对象的一般人口学资料分析Tab.1 Analysis of demographic data of the two groups
2.2 肠道菌群相对丰度分析
对所有受试者的粪便样本进行测序,共获得5 189 630对Reads。对双端Reads质控、拼接共产生4 397 016条Clean Reads,其中Q20、Q30均在97%以上,表明质控数据良好,能够满足实验分析要求。
2.2.1 PPD 组的α多样性降低 α多样性反映的是单个样品物种丰度及物种多样性,可以在物种丰富度和多样性两个方面显示PPD 组和PPHC组产妇肠道菌群的特点,有多种衡量指标:Chao1、Ace、Shannon、Simpson等。Chao1和Ace指数衡量物种丰富度即物种数量的多少;Shannon 和Simpson 指数用于衡量物种多样性。粪便α多样性指数如图1 所示,与PPHC组相比,PPD组可以观察到的OTU 数量明显减少(t=4.769,P＜0.001)、α多样性显著降低。Chao1(t=5.222,P＜0.001)和Ace(t=4.926,P＜0.001)均具有统计学差异,PPD 组的Shannon指数(t=1.686,P=0.098)和Simpson指数(t=1.183,P=0.241)均低于PPHC组,但两组之间差异无统计学意义。
图1 α多样性分析Fig.1 Analysis of α diversity
2.2.2 β多样性分析 β多样性是对不同组间进行肠道菌群结构的比较,本研究基于非加权UniFrac距离矩阵进行了主坐标分析。坐标图上距离越近的样品,相似性越高,差异越小。如图2所示,与PPHC组相比,PPD 组内样本分布更离散,而且两组之间存在统计学差异(P=0.01)。
图2 β多样性PCoA主成分分析Fig.2 Analysis ofβdiversity PCo A principal components
2.2.3 微生物群落的物种分布差异 根据两组在门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)、种(species)的物种分布绘制柱状图(图3),计算不同的水平上两组菌群的相对丰度差异。在门水平上,p-Planctomycetes 只存在于PPD组,而p-Epsilonbacteraeota只存在于PPHC组,但是它们在两组中丰度均较低。p-Bacteroidetes和p-Firmicutes在PPD和PPHC中均为优势门,但是相比于PPHC组,PPD 组的p-Bacteroidetes升高,p-Actinobacteria降低。在属水平上,g-Bacteroides的相对丰度在两组中均最高,PPD组占32.221%,PPHC组占21.874%,但组间差异无统计学意义。g-Ruminococcus(P=0.008)、g-Bifidobacterium(P=0.021)和g-Kineothrix(P=0.025)在两组之间存在统计学差异。
2.2.4 组间差异的显著性分析 LEfSe(linear discriminant analysis effect size,线性判别分析)即LDA Effect Size分析,是一种发现和解释高纬度数据生物标识的分析工具。为了进一步研究两组间丰度的差异并探讨与PPD 相关的特定菌属,本研究对两组的粪便微生物组成进行了LEfSe分析,结果发现29种细菌类群的相对丰度在两组之间存在明显差异(LDA score＞2.0,P＜0.05,图4)。在PPD 组中,Acetanaerobacterium、Adlercreutzia、Allobaculum、Alloprevotella、Bifidobacterium、Christensenella、Escherichia、Eubacterium、Faecalicatena、Fusobacterium、Haemophilus、Intestinimonas、Lactobacillus、Megamonas、Monoglobus、Muribaculum、Oscillospira、Paraprevotella、Streptococcus、Raoultibacter、Ruminococcus、Stomatobaculum等菌属显著富集,而Kineothrix、Lachnoclostridium、Acinetobacter、Aquisphaera、Enterococcus、Mucispirillum在PPHC组中显著富集,值得注意的是Kineothrix在PPD 组显著富集(LDA score=4.124,P=0.001),但Bifidobacterium在PPHC中显著富集(LDA score=4.126,P=0.026)。
图4 PPHC组和PPD组患者样本差异物种的LDA值分布图Fig.4 The distribution of LDA values of the different species in PPHC group and PPD group
2.2.5 肠道菌群相对丰度与临床指标的相关性 如图5所示,肠道菌群相对丰度与临床指标的潜在关联。根据冗余分析/典范对应分析(RDA/CCA),研究年龄、BMI和EPDS得分和肠道微生物群的相关性,结果显示年龄与Ruminococcus、Subdoligranulum等菌呈正相关;BMI与Roseburia、Bacteroides、Lachnospira呈正相关;EPDS 得分与Prevotella、Kineothrix、Alistipes呈正相关,而与Lachnospira呈负相关。
图5 肠道菌群的相对丰度与临床指标的相关性Fig.5 Correlation between relative abundance of intestinal flora and clinical indicators
本研究共纳入30例PPD者,30例产后非抑郁的产妇进行比较分析。结果显示,与PPHC组相比,PPD组的α 多样性降低,β 多样性升高。门水平上,p-Planctomycetes 只存在于PPD组,而p-Epsilonbacteraeota 只存在于PPHC 组。p-Bacteroidetes 和p-Firmicutes在PPD和PPHC中均为优势门。但是相比 于PPHC组,PPD组的p-Bacteroidetes 升高,而p-Firmicutes和p-Actinobacteria降低。在属水平进行分析发现,PPD 组中g-Ruminococcus和g-Bifidobacterium显著降低,g-Kineothrix显著升高。
近年来关于抑郁症患者肠道菌群的研究日益增多,但结论差异较大。ZHOU等[11]对深圳地区的16例健康对照者和28例PPD 患者进行了肠道微生物检测,发现PPD组的β多样性明显大于对照组,α多样性在两组之间并没有统计学差异,门水平分析发现PPD 组p-Firmicutes的比例高于对照组。HU 等[14]对抑郁症的研究发现,抑郁症患者的菌群多样性降低。ZHENG等[15]发现,抑郁症患者的肠道菌群与健康对照相比,α多样性无显著差异,而β多样性显著不同,Actinomycetes数量增多,Bacteroidetes数量减少。YANG等[16]通过宏基因组学分析也发现,Eubacterium 在重度抑郁的患者中降低。推测结果不一致可能与地域差异、饮食习惯、样本量、测序平台、样本保存方法、药物使用、疾病状态等因素有关。研究表明,饮食对肠道微生物群有一定影响[17]。随着纬度的增加,人群肠道内的p-Firmicutes数量增多,p-Bacteroidetes相对减少[18]。因此,对不同地区的PPD患者肠道菌群进行分析将有助于更好地解释疾病的发生与发展,为临床治疗提供更大的支持。本研究集中于西北地区当地产妇,通过饮食结构询问,研究人群饮食结构差异较小,排除饮食及地域对于肠道菌群干扰,增加了研究结果的可靠性。
组间差异分析结果显示,g-Ruminococcus,g-Bifidobacterium在PPD 组中显著降低,而g-Kineothrix在PPD 组中升高。与CHEUNG 等[19]对肠道微生物与重度抑郁症进行的系统分析结果一致。Ruminococcus属于革兰氏阳性严格厌氧球菌,主要通过分解宿主消化系统的纤维素来产生乙酸酯、丙酸盐以及具有抗炎效应的丁酸盐,具有稳定肠道屏障、逆转腹泻、降低结直肠癌风险、减少肾结石的功能。Bifidobacterium是人体肠道中最重要的正常菌群之一,对人体健康具有生物屏障、营养、抗肿瘤、增强免疫、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能。PINTO-SANCHEZ 等[20]对肠易激综合征患者的一项双盲实验发现,相比于服用安慰剂,服用Bifidobacterium可以有效缓解患者的抑郁情绪,改善生活质量。AIZAWA 等[21]对细菌qPCR 反应研究也发现,Bifidobacterium计数较低的个体在抑郁症患者更常见。推测PPD 的发生与Ruminococcus、Bifidobacterium等肠道益生菌的降低有很大的关系。Kineothrix alysoides是从土壤中发现的一种厌氧杆菌,可以利用多种碳源产生丁酸[22]。目前尚不明确PPD 患者中Kineothrix alysoides显著升高的原因,还需要更多的研究来验证本研究的发现。
本研究通过对肠道菌群相对丰度与临床指标进行相关性分析,发现EPDS得分与Prevotella、Kineothria、Alistipes呈正相关,而与Lachnospira呈负相关。与CHEUNG 等[19]的研究结果一致。Prevotella增加机体的炎症反应,Lachnospira可改善肠道菌群的分布,拮抗有害菌定植有关,进一步提示PPD的发生可能与肠道菌群改变所引起的一系列机体变化有关,详细机制仍有待进一步研究。
综上所述,PPD 的形成可能与肠道有益菌的减少引起的肠道菌群紊乱,进而引起肠道功能失调有关。但是,本研究纳入的患者数量较少,入组主要采取量表评估,仅代表抑郁状态,无法明确诊断抑郁症,且对菌群紊乱与抑郁症状之间关系的机制探索不足。未来的研究将进一步扩大样本量,对PPD 患者进一步详细划分,同时辅助基础实验,对于肠道菌群与PPD 表型及机制进行深入挖掘,期待能为PPD 患者的临床治疗提供新的思路。
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