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焦 雪， 黄树宣
帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是最常见的神经退行性疾病之一，多发于60岁以上的中老年人。该病隐匿起病，缓慢进展，主要临床表现包括静止性震颤、运动迟缓、肌肉强直等运动症状和睡眠障碍、植物神经功能紊乱等非运动症状。PD的典型病理特征为中脑黑质致密部多巴胺神经元的变性和神经元内α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)聚集形成路易小体。迄今为止，PD发病机制尚未完全清楚，研究认为是线粒体功能障碍、氧化应激、神经炎症等多种机制综合作用导致的。正由于发病机制复杂，PD治疗研究进展缓慢，目前尚无有效的根治方法，临床上主要以药物治疗延缓疾病的进程为主。近年来，越来越多的研究证实核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体活化与炎性相关疾病的发生发展密切相关[1]，其所诱发的神经炎症在PD的发病机制中发挥了重要作用。本文围绕NLRP3炎症小体，论述其在PD病理环境下的活化机制和在PD发病机制中的作用，并讨论靶向NLRP3炎症小体的PD治疗研究新进展。
1.1NLRP3炎症小体的结构和组装 NLRP3炎症小体是目前备受关注的炎症小体类型，亦是近年被发现与中枢神经系统疾病关系最为密切的炎症小体，其由三种胞内成分构成，分别为感受器NLRP3受体蛋白、适配器凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a CARD,ASC)和效应器caspase-1前体蛋白(pro-caspase-1)。NLRP3受体蛋白是NLRP3炎症小体的核心部分，由位于中央的NACHT结构域、N-端热蛋白结构域(pyrin domains,PYD)和C-端的亮氨酸富集重复结构域(leucine-rich repeat,LRR)组成(见图1)。其中，NACHT富含ATP酶，在危险信号相关分子模式(danger-associated molecular patterns,DAMP)或病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)信号刺激下可调控NLRP3蛋白的寡聚化。NLRP3寡聚化后，其N-端的PYD可通过相互作用招募和结合ASC，ASC再通过其C端的CARD结构域相互作用募集pro-caspase-1，从而组装形成NLRP3炎症小体[2]。
1.2NLRP3炎症小体的激活方式 目前认为NLRP3炎症小体经典的活化途径需要两个信号步骤，分别为启动和激活。启动阶段，细胞在炎症刺激信号下，核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号通路被激活，从而上调前体蛋白[包括NLRP3、pro-白细胞介素(interleukin,IL)-1β和pro-IL-18等]的表达。激活阶段，细胞在DAMP或PAMP的作用下，NLRP3、ASC和pro-caspase-1发生结合而完成炎症小体的组装。组装后，pro-caspase-1被催化切割成为具有酶活性的caspase-1，caspase-1将pro-IL-1β和pro-IL-18裂解为成熟且有生物活性的IL-1β和IL-18，从而促进炎症反应[3](见图1)。此外，NLRP3炎症小体完成组装后，生成的caspase-1可作用于消皮素D(gasdermin D,GSDMD)，使其分解为具有打孔特性的N端结构域，在细胞膜上形成孔洞，介导细胞焦亡[4](见图1)。
NLRP3炎症小体由NLRP3、ASC和pro-caspase-1组成。NF-κB信号通路激活引起炎症小体相关成分前体蛋白表达增加，NLRP3寡聚化后结合ASC和pro-caspase-1而完成激活。炎症小体活化后，释放出IL-1β和IL-18，介导炎症反应和细胞焦亡图1 NLRP3炎症小体的结构及活化方式
神经炎症是多种中枢神经系统疾病的共同病理特征。据报道，神经炎症在神经系统中扮演双刃剑的角色，适度的炎症反应可清除坏死细胞和毒性蛋白质，并维护血脑屏障的稳定，利于疾病恢复，但过度的炎症反应则会引起炎性细胞因子大量释放，破坏血脑屏障、线粒体功能及细胞能量代谢，加重脑组织的损伤[5]。在中枢神经系统中，参与炎症反应的主要细胞类型为小胶质细胞和星形胶质细胞，前者发挥免疫监视功能，但异常激活的小胶质细胞对神经元具有毒性作用[6]，后者除了参与神经炎症反应，还具有神经营养、吞噬清除、维持微环境稳态等功能[7]。NLRP3炎症小体活化是诱发神经炎症反应的关键，其在中枢神经系统中主要定位在小胶质细胞和星形胶质细胞胞浆内[8]。在脑卒中、颅脑创伤、阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)、PD、多发性硬化等疾病病理状态下，NF-κB信号通路被激活，NLRP3和pro-IL-1β、pro-IL-18等前体蛋白表达增加，触发了NLRP3炎症小体活化的启动阶段。在活性氧(reactive oxygen species,ROS)、钾离子失衡、线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)等作用下，NLRP3炎症小体的成分发生组装而启动其激活阶段[2]。更值得关注的是，NLRP3炎症小体在中枢神经系统的活化还与β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)、tau蛋白和α-syn等错误折叠蛋白的表达、聚集息息相关。在AD、PD等神经系统变性病中，Aβ、α-syn既可激活NLRP3炎症小体活化的启动阶段，还可以直接或通过破坏线粒体、释放活性氧簇等间接的方式促进该炎症小体的组装、激活。NLRP3炎症小体活化后诱发神经炎症反应，长期的慢性炎症可加重脑内Aβ、α-syn的错误折叠和堆积，形成错误折叠蛋白堆积和NLRP3炎症小体活化之间的恶性循环[9]，而抑制脑内NLRP3炎症小体的活化可减轻神经炎症反应[10]。由此可见，NLRP3炎症小体在中枢神经炎症反应中扮演着重要角色。
3.1NLRP3炎症小体在PD中的表达 对PD患者的尸体解剖证据表明，与健康对照者比较，NLRP3的mRNA水平在PD患者脑组织中升高，并且NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表达也升高[11]，提示NLRP3炎症小体在PD患者脑组织中被活化。提取PD患者与健康对照组的外周血进行分析比较，发现NLRP3、caspase-1在PD患者的外周血中升高明显[12]，并且NLRP3的升高水平与α-syn总含量显著相关，经分析还证实炎症小体的活化与PD患者的运动症状呈正相关[13]。随访20例PD患者和15名健康对照者的研究还发现，PD患者血清中NLRP3蛋白水平与发病1年后疾病的进展和病情严重程度显著相关[14]。对NLRP3基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分析表明，rs7525979与PD患病风险降低有关，进一步的研究证实SNP rs7525979可改变NLRP3基因的翻译过程，从而影响NLRP3蛋白的稳定性和泛素化[15]。在各种PD疾病模型的基础研究中也证实了NLRP3炎症小体被活化。过表达α-syn的A53T转基因小鼠或采用α-syn原纤维中脑立体定位注射构建的PD模型小鼠中，可观察到小鼠中脑组织的NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β蛋白表达升高，提示NLRP3炎症小体被活化[16-17]。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)是常用的PD模型毒性诱导剂，尽管急性、亚急性和慢性模型的MPTP给药时间及剂量有所差别，但在MPTP诱导的急性/亚急性/慢性模型小鼠脑组织中均观察到NLRP3炎症小体被活化[11，18-19]。6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)是除MPTP之外另一种常用于构建PD疾病模型的神经毒性物质。6-OHDA注射至小鼠纹状体后，可观察到黑质-纹状体系统NLRP3、caspase-1的蛋白表达以及NLRP3、IL-1β和IL-18的mRNA水平升高[20]，提示6-OHDA可诱导脑内NLRP3炎症小体活化。
3.2NLRP3炎症小体在PD中的活化机制及可能的致病机制 NLRP3炎症小体的活化包括启动和激活两个步骤。在PD的病理生理改变中，Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)、肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)、IL-1受体1型(IL-1 receptor type 1,IL-1R1)和CD36受体等参与了NF-κB信号通路的激活，与NLRP3炎症小体活化的启动步骤密切相关。α-syn单体毒性低，但其错误折叠、异常聚集后形成具有毒性的α-syn多聚体，多聚体可直接作用于TLR2/4受体，并通过激活MyD88/IKKα/IKKβ和MyD88/IκBα信号通路诱导NF-κB发生核转移，从而激活NF-κB信号通路(见图2)。CD36作为小胶质细胞的清道夫受体，可识别和介导α-syn的吞噬清除。α-syn与CD36结合后招募胞浆内的Fyn激酶，Fyn激酶通过磷酸化PKCδ而激活PKCδ依赖性的NF-κB信号通路，进而触发NLRP3炎症小体活化的启动步骤[17](见图2)。MPTP可作用于TLR4受体，从而激活NF-κB信号通路，而敲除TLR4受体可抑制MPTP诱导的NF-κB信号通路激活及NLRP3炎症小体活化[21]。另外，在PD的发展过程中，长期的慢性炎症刺激使TNF-α、IL-1β炎性细胞因子产生增加，分别作用于小胶质细胞膜上的TNRF和IL-1R1受体，促使胞浆内NF-κB向胞核转移而激活NF-κB信号通路(见图2)。NLRP3炎症小体的激活步骤与溶酶体破坏、线粒体功能障碍、K+外流等有关。α-syn被小胶质细胞识别、吞噬后，可破坏溶酶体稳态，使具有活性的cathepsin B从溶酶体释放到胞浆，cathepsin B在胞浆中促进NLRP3炎症小体的组装而完成激活步骤[22](见图2)。另一方面，α-syn在小胶质细胞内可破坏线粒体功能，向胞质释放出线粒体活性氧(mitochondrial ROS,mtROS)和mtDNA，进而激活NLRP3炎症小体[23](见图2)。因此，作为PD的核心致病蛋白，α-syn与NLRP3炎症小体活化的关系极为密切，既可触发炎症小体活化的启动步骤，同时可促进炎症小体活化的激活步骤。MPTP、6-OHDA和鱼藤酮也均被证实可破坏线粒体功能，通过诱导mtROS促进NLRP3炎症小体的激活[10](见图2)。NLRP3炎症小体在PD中的活化还可能与低水平的多巴胺神经递质相关。多巴胺与多巴胺受体(dopamine receptor,DR)D1结合后促使第二信使环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)与NLRP3结合，cAMP通过E3泛素化连接酶MARCH7促进NLRP3泛素化降解，从而负向调控NLRP3炎症小体的活化[24]。多巴胺与小胶质细胞上的受体结合后还可抑制α-syn诱导的K+外流依赖的NLRP3炎症小体活化[25]。与PD发病相关的parkin基因也参与了NLRP3炎症小体的活化。正常情况下，NLRP3蛋白是parkin的底物，parkin可泛素化降解NLRP3蛋白而抑制炎症小体的启动步骤，而敲除parkin基因不仅其泛素化作用被消除，并且导致其相互作用的底物ZNF746沉积，该底物可诱导mtROS的生成，进而促进NLRP3炎症小体的激活[26]。NLRP3炎症小体活化后，产生的炎性细胞因子IL-1β通过炎性级联效应导致炎症风暴，并诱发α-syn错误折叠、异常聚集而产生细胞毒性作用(见图2)。NLRP3炎症小体活化后产生的caspase-1还可将α-syn单体截断和聚集为聚合体，诱发PD样病理改变[27]。另外，caspase-1可以剪切GSDMD的N端，从而在细胞膜上形成孔径，触发神经细胞发生一种被称为焦亡的程序性细胞死亡，加重神经元的变性、丢失(见图2)。
在PD发病过程中，TLRs受体、TNRF受体、IL-1R1受体、CD36受体参与NF-κB信号通路的激活，触发炎症小体活化的启动步骤，在线粒体损伤释放的mtROS、mtDNA以及溶酶体破坏释放的cathepsin B作用下，NLRP3炎症小体发生组装激活，从而诱发炎症反应、细胞焦亡和α-syn的细胞毒性作用图2 NLRP3炎症小体在PD中的主要活化方式及可能致病机制图[9]
4.1靶向抑制NLRP3炎症小体活化而发挥PD保护作用的小分子抑制剂或化合物 目前，已经有部分抑制NLRP3炎症小体活化的小分子抑制剂或化合物被证实对PD模型具有保护作用。MCC950，NLRP3的一种选择性抑制剂，被证实可抑制α-syn诱导的小胶质细胞NLRP3炎症小体活化和胞外ASC的释放，并且口服MCC950可抑制α-syn原纤维和6-OHDA注射小鼠引起的NLRP3炎症小体的活化，减少α-syn的异常聚集和多巴胺神经元丢失[28]。在MPTP诱导的PD亚急性小鼠模型中，腹腔注射MCC950可抑制NLRP3炎症小体活化而减轻中脑黑质的神经炎症，改善小鼠的PD样运动障碍[29]。MCC950还可以抑制锰诱导的NLRP3炎症小体活化，减轻锰介导的体内、外模型的神经毒性作用[30]。多巴胺受体激动剂普拉克索与多巴胺D3受体结合后，可提高星形胶质细胞的自噬水平，抑制NLRP3炎症小体活化，对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)脑内注射诱导的PD小鼠发挥保护作用[31]。褪黑素是一种具有多种功效的吲哚杂环类化合物，在多种神经系统疾病模型中具有保护效应。在MPTP诱导的PD模型中，褪黑素通过激活SIRT1信号通路抑制NLRP3炎症小体的活化，改善MPTP诱导的神经毒性损伤[32]。由肠道菌群合成的天然化合物尿石素A可修复MPTP破坏的线粒体自噬，抑制NLRP3炎症小体活化，从而缓解MPTP诱导的神经毒性作用[33]。
4.2靶向抑制PD中NLRP3炎症小体活化的microRNA(miR) 随着研究的不断深入，越来越多的miR被证实在PD中可调控NLRP3炎症小体的活化。研究发现，miR-7除能够靶向α-syn外，还可靶向NLRP3基因调控NLRP3炎症小体的活化，从而减轻MPTP小鼠中脑黑质小胶质细胞的激活和多巴胺神经元的丢失[16]。miR-188-3p可分别靶向NLRP3和细胞分裂蛋白激酶5而抑制NLRP3炎症小体活化和细胞自噬活动，进而对PD模型发挥保护作用[34]。miR-30e和miR-190均被证实可通过靶向NLRP3基因抑制炎症小体的活化，进而改善MPTP诱导的PD样病理改变或小鼠的行为运动缺陷[35-36]。研究还发现，miR-135b通过靶向其下游的FoxO1转录因子抑制NLRP3炎症小体的活化，对MPTP代谢产物MPP+干预的神经元起保护作用[37]。而另一MicroRNA-miR-29c-3p通过靶向活化T细胞核因子5调控NLRP3炎性小体的活化，在PD模型中发挥抗炎作用[38]。
4.3中医药、运动训练或其他可抑制PD中NLRP3炎症小体活化的方法 在PD的研究中，已有多种中草药或中草药提取物被发现可抑制不同PD疾病模型中NLRP3炎症小体的活化。补肾益智方是一种由牡丹皮、人参根、何首乌、枸杞和女贞子等组成的传统中药，可抑制MPTP及MPP+诱导的NLRP3炎症小体活化，减轻小胶质细胞和小鼠脑内的神经炎症，改善多巴胺神经元变性和小鼠运动障碍[39]。金丝桃苷，中草药黄秋葵的活性提取化合物，可上调垂体腺苷酸环化酶激活肽而抑制NLRP3炎症小体的活化，发挥减轻MPTP诱导的神经炎症和保护多巴胺神经元的作用[40]。同样在MPTP诱导的PD模型中，穿心莲内酯可促发parkin介导的线粒体自噬，抑制小胶质细胞NLRP3炎症小体的活化，改善MPTP小鼠的运动缺陷[41]。黄芪也被发现可通过抑制NF-κB信号通路和减少ROS产生而抑制NLRP3炎症小体的活化，从而对MPTP毒性发挥保护作用[42]。此外，红景天甙、芫花素、大麻二酚等也被证实可抑制MPTP诱导的PD模型中NLRP3炎症小体的活化[43-45]。在6-OHDA诱导的PD模型中，樟芝多糖通过减少ROS的释放而抑制NLRP3炎症小体的活化[46]。丁苯酞可通过修复线粒体损伤而抑制NLRP3炎症小体的活化，进而改善小鼠运动缺陷和多巴胺神经元变性[47]。除了上述的抑制剂、化合物、miR和中草药外，尚有一些方法也可抑制PD模型中NLRP3炎性小体的活化。有学者发现，跑步运动训练可抑制MPTP小鼠脑内的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，进而抑制NLRP3炎性小体的活化[19]。静脉注射人脐带间充质基质细胞可同时抑制MPTP诱导的脑内和外周的NLRP3炎症小体活化[48]。将正常大鼠的肠道菌群移植至锰暴露环境下的大鼠体内，观察到受植大鼠脑内的NLRP3炎症小体活化被抑制，锰的神经毒性作用被减弱，提示肠道菌群可通过抑制NLRP3炎症小体减轻锰介导的神经损伤[49]。
越来越多的证据表明，NLRP3炎症小体活化介导的神经炎症反应在PD的病理机制和疾病进展过程中发挥着不可忽视的作用，以NLRP3炎症小体为靶点的PD治疗研究策略也逐渐被发掘。然而，尽管绝大部分研究表明NLRP3炎症小体活化在PD中起破坏作用，但其在外周的免疫稳态中具有重要保护作用，因此该炎症小体在PD中的确切作用可能需进一步深入研究确认。此外，NLRP3炎症小体在PD中的活化机制及其与核心致病蛋白α-syn的相互作用关系仍未完全清楚。因此，深入研究NLRP3炎症小体在PD中的作用、活化机制及其与α-syn的关系，从而探索以NLRP3炎症小体为靶点的PD治疗新策略将具有重要意义，可能为PD等NLRP3炎症小体相关疾病提供新的治疗思路。
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