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李先义，张金磊，陈永发，张 飞，巩婧婷，王 远
（新疆农垦科学院分析测试中心，新疆 石河子 832000）
目前，检测地西泮比较常用的方法有液相色谱法[7]、气相色谱串联质谱法[8]、液相色谱串联质谱法[9]，液相色谱-飞行时间质谱法[10]等。但是，针对鸡蛋中地西泮的检测方法未见报道。通过对提取溶剂和净化方法等前处理条件的选择，且优化了液相条件和质谱参数，建立了高效液相色谱串联质谱快速检测鸡蛋中地西泮的方法，该方法灵敏度高、准确性好、高效、快速，适用于鸡蛋中地西泮残留的筛查和测定。
1.1 试剂与材料
甲醇、乙腈、甲酸（HPLC级），德国CNW公司提供；
甲硝唑（纯度大于99.0%），德国Dr.Ehrenstorfer公司提供；
超纯水。
鸡蛋去壳，经匀浆（转速10 000 r/min）后，置于-20℃下冷冻保存备用。
1.2 仪器设备
Agilent 1200-6460型液质联用仪，美国Agilent公司提供；
Sigma 3-30k型高速冷冻离心机，德国Sigma公司提供；
MS3 basic型漩涡混合器，德国IKA公司提供；
KQ-600DE型，昆山市超声仪器有限公司超声波清洗器；
IQ7000型超纯水仪，美国MilliQ公司提供。
1.3 仪器条件
色谱条件：色谱柱（ZORBAX SB-Aq Solvent Saver Plus，3.0 mm×100 mm，3.5 μm），柱温30℃，流动相组成（水-乙腈，梯度），进样量5 μL，流速0.6 mL/min，梯度洗脱。
以水-乙腈为流动相的梯度洗脱程序见表1。
表1 以水-乙腈为流动相的梯度洗脱程序
质谱条件：离子化模式（电喷雾离子源(ESI)，正离子模式），质谱扫描方式（多反应监测），毛细管电压4 000 V，干燥气温度325℃，干燥气流量10 L/min，鞘气温度350℃，鞘气流速12 L/min。
地西泮的质谱参数见表2。
表2 地西泮的质谱参数
1.4 样品前处理
称取经匀浆后的鸡蛋2.00 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入0.2%甲酸乙腈溶液10 mL，涡旋振荡混匀1 min，30℃下恒温超声提取30 min；
以转速10 000 r/min离心5 min，取上清液5 mL直接加入到PRiME HLB固相萃取小柱上，无需活化，控制流速在3～4 mL/min，收集全部流出液。于40℃下水浴氮吹至近干，用0.1%甲酸水+甲醇（90+10）溶液定容2 mL，涡旋混匀后过0.22 μm有机微孔滤膜，供UPLC-MS/MS法测定。
1.5 标准溶液的配制
准确称取地西泮标准品25 mg，用甲醇溶于25 mL容量瓶中，配制成质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备溶液，置于-20℃下避光保存。准确移取0.025 mL标准储备液至25 mL容量瓶中，用甲醇定容，配置成1 μg/mL的标准中间溶液，用基质空白溶液将标准中间溶液逐级稀释配制成0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL的地西泮系列工作溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，供高效液相串联质谱仪检测。
2.1 质谱和色谱条件的优化
2.1.1 质谱条件的优化
在电喷雾电离和多反应监测模式下，对100 ng/mL甲硝唑标准溶液多次注射进样，通过对鞘气温度、鞘气流速、毛细管电压、碰撞电压、碰撞能量等质谱参数进行优化。选择稳定性好、离子丰度比高和干扰较小的2个碎片离子作为地西泮的定性离子和定量离子，并以响应值较高的离子对作为定量离子对。
地西泮的MRM离子对质谱图见图1。
图1 鸡蛋空白样品添加质量浓度为5 ng/mL的基质标
图1 地西泮的MRM离子对质谱图
2.1.2 色谱条件的优化
通过比较水-乙腈、水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇4种流动相体系对地西泮响应值的影响。结果发现，当流动相为水-乙腈体系，地西泮的响应较高，因此试验选择水-乙腈体系作为检测鸡蛋中地西泮的流动相。
不同流动相体系对地西泮提取效率的影响见图2。
图2 鸡蛋空白样品LC-MS/MS谱图
图2 不同流动相体系对地西泮提取效率的影响
2.2 提取和净化条件的选择与优化
机溶剂中，难溶于水，在乙酸乙酯和乙腈中有较好的溶解性。故选择乙酸乙酯和乙腈作为提取溶剂，同时比较了2种溶剂的提取效果，结果发现，乙酸乙酯提取时会提取出较多的杂质，且对仪器干扰较
大。而乙腈作为提取溶剂时，不仅提取效率高，且
具有沉淀蛋白的作用。但是，不论乙酸乙酯还是乙
腈作为提取溶剂，提取液中都含有大量的脂肪和磷脂类物质，这些物质会干扰LC-MS分析，干扰目标分析物。所以试验选择用PRiME HLB小柱进行净化，PRiME HLB小柱可有效去除大部分的脂肪和磷脂类物质，从而达到净化提取液，降低干扰物的目的。
3.1 线性关系和检出限
取6份鸡蛋的空白样品，样品经过前处理得到空白基质，取一定量的地西泮标准中间液，用空白基质溶液稀释成适当的质量浓度，配制成标准系列工作曲线，在优化后的前处理和仪器条件下，对基质标准曲线溶液进行测定，以定量离子峰面积为纵坐标，以质量浓度为横坐标进行回归分析。结果表明，地西泮在0.5～10.0 ng/mL范围内呈现良好的线性关系，线性相关系数为0.999（R2=0.999）。根据信噪比计算得到，地西泮的检出限（S/N=3）为0.5 μg/kg，地西泮的定量限（S/N=10）为1 μg/kg。该方法线性关系良好、灵敏度高。
地西泮的线性方程、线性范围、相关系数见表3。
表3 地西泮的线性方程、线性范围、相关系数
3.2 回收率和精密度
选取1份鸡蛋空白样品，按照试验方法进行3个浓度水平添加测定回收率，每个水平重复测定6次。鸡蛋中地西泮平均回收率为85%～102.5%，相对标准偏差为2.6%～4.7%。结果表明，该方法回收率和精密度良好。
地西泮的回收率和精密度见表4，鸡蛋空白样品添加质量浓度为5 ng/mL的基质标见图3，鸡蛋空白样品LC-MS/MS谱图见2，鸡蛋样品中添加量为2 μg/kg的LC-MS/MS谱图见3。
图3 鸡蛋样品中添加量为2 μg/kg的LC-MS/MS谱图
表4 地西泮的回收率和精密度
试验采用ZORBAX SB-Aq型色谱柱分离，优化了液相、质谱仪器参数和前处理条件，包括提取溶剂、净化方法等因素，提高了鸡蛋中地西泮的提取和净化效率。在方法学验证测定结果中表明，方法准确性好、灵敏度高、快速、高效，适于鸡蛋中地西泮的快速筛查和测定。
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