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柯昌虎，王运文，严慧，冯协和，刘佳玲，李志浩
乳腺癌严重危害着人类健康，是女性癌症病人主要致死原因之一［1］。2020年全球新增癌症病人高达1 929万例，其中乳腺癌占比11.7%，成为人类发病率最高的癌症［2］。乳腺癌疾病形成的机制较为繁杂，不同分子亚型的遗传特征和临床特征差异明显［3］，同时乳腺癌具有显著的化疗耐药，对现有有限的治疗手段产生巨大的挑战，如何对治疗药物进行减毒增效，一直是人们关注的问题。
康艾注射液是常见的抗癌中药，其组成成分为黄芪、人参和苦参素，它不仅可以提高机体的免疫力，还可以抑制或杀灭多种癌细胞［4-5］。在我国临床上，康艾注射液广泛应用于乳腺癌的治疗，帮助改善病人的生存质量，减少化疗反应［6］。对90例乳腺癌病人进行分组治疗，发现康艾注射液可以作用于磷脂酰肌醇-3-激酶-丝氨酸∕苏氨酸蛋白激酶（PI3k-Akt）通路，发挥提质增效的作用［7］；
康艾注射液结合新辅助化疗可以有效降低女性三阴型乳腺癌（TNBC）病人肿瘤标志物的水平［8］。现代药理研究发现，采用康艾注射液干预SK-BR-3等四种人类乳腺癌细胞系，可以产生抑制细胞增殖和促进细胞凋亡作用，其机制与腺苷酸活化蛋白激酶∕哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（AMPK∕mTOR）通路密切相关［9］。尽管康艾注射液具有明显的抗乳腺癌作用，但其化学成分复杂，治疗乳腺癌的物质基础及分子机制有待明确。
网络药理学通过构建“药物-基因-疾病”的模块结构，从整体水平反映出中药干预疾病调控机制［10］，从而为阐明药物治疗相关疾病的提供新的方法。分子对接可以揭示配体（药物分子）和受体（蛋白）的相互作用，结合网络药理学可以促进药效物质的明晰和药效解释［11］。本研究起止时间为2021年3—6月，采用网络药理学构建康艾注射液-乳腺癌靶点网络，探讨其可能的抗癌机制。
1.1 康艾注射液活性成分及靶点的筛选检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）收集康艾注射液中黄芪和人参的活性成分，选择口服生物利用度（OB）、类药性（DL）两项作为控制指标，分别不小于30%、0.18，以此筛选活性成分及靶点［12］。苦参素即氧化苦参碱，在PubChem数据库中查找其SMILES，并导入SwissTargetPrediction数据库中查找靶点，最后在Uniprot数据库中校正基因的名称。
1.2 乳腺癌疾病相关靶点的筛选以“breast cancer”为检索词，在GeneCards和OMIM数据库中获取乳腺癌的相关靶点，其中GeneCards以基因关联性评分≥15为筛选条件。
1.3 活性成分-疾病共有靶点的筛选打开Venny 2.1在线平台，将康艾注射液与乳腺癌的靶点录入，绘制出韦恩图，并获取二者的共有靶点。
1.4 药物-成分-乳腺癌-靶点网络构建运行Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物-成分-疾病-靶点”互作网络，使用Network Analyzer功能以节点度值（degree）为指标进行可视化分析。
1.5 蛋白互作网络构建将共有靶点上传至STRING数据库，设置Organism类型为“Homo sapiens”，选择交互作用＞0.9的靶点，导入Cytoscape 3.7.2软件绘制PPI可视化网络。
1.6 富集分析使用David 6.8数据库分别进行GO与KEGG富集分析。以P＜0.01为阈值进行数据筛选，探讨康艾注射液抗乳腺癌的生物学过程和信号通路。
1.7 分子对接验证从蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB）数据库获取蛋白受体的3D结构，使用AutoDock Vina将“靶点-成分”进行模拟对接。结合自由能小于0，则表明药物成分的分子和配体受体可以自发结合，结合打分值越低则形成的复合物越稳定。
2.1 康艾注射液主要活性成分及作用靶点在TCMSP数据库共检索到277个化学成分，包括黄芪87个，人参190个，其中OB≥30%和DL≥0.18的成分41个；
苦参素的主要化学成分为氧化苦参碱。结果共获得康艾注射液的活性成分42个，其中山柰酚（kaempferol）为黄芪和人参的共有成分，见表1。对获取的靶点进行合并去重，去除无靶点成分，最终32个候选化合物共筛选出290个药物作用靶点。
表1 康艾注射液的活性成分信息
2.2 疾病靶点的检索及药物活性成分-疾病共有靶点的筛选使用Geencards、OMIM数据库分别获得乳腺癌靶点1 375个（相关性评分≥15）、256个，两者整合并去除重复数据，最终筛选出乳腺癌靶点1 530个。将药物和疾病的靶点进行Venny分析，二者取交集后得到康艾注射液和乳腺癌共有靶点125个。
2.3 药物-成分-靶点-疾病网络构建在Cytoscape 3.7.2软件中，分别输入康艾注射液的成分、靶点等数据，制作“药物-成分-靶点-疾病”可视化互作网络图，见图1。图中蓝色椭圆形、黄色长方形、绿色方形、红色菱形分别代表中药、成分、靶点、乳腺癌。其中异鼠李素（isorhamnetin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、氧化苦参碱（oxymatrine）作用靶点较多，可能为药物发挥抗乳腺癌作用的关键活性成分，见表2。
表2 康艾注射液的关键活性成分信息
2.4 蛋白相互作用网络构建在STRING数据库中物种设定为“Homo sapiens”，选取置信度＞0.9的网络数据，绘制可视化网络，结果如图2所示。Degree值前五位的靶点依次是TP53（degree=37）、AKT1（degree=37）、JUN（degree=33）、MAPK1（degree=33）、TNF（degree=327），可能在治疗乳腺癌中发挥重要调控作用。
2.5 GO功能分析结果运用DAVID数据库对康艾注射液活性成分抗乳腺癌靶点进行GO分析，以P＜0.01为筛选条件，结果有411条生物学过程，其中生物过程（BP）314条，主要涉及序列特异性DNA结合转录因子活性的正向调控、炎症反应、细胞周期调节等；
细胞成分（CC）32条，主要涉及细胞核、细胞外空间、核染色质等；
分子功能（MF）65条，主要与蛋白磷酸酶结合、染色质结合、细胞因子活性等相关。GO分析结果表明康艾注射液通过参与调控多个生物过程而产生抗乳腺癌作用。
2.6 KEGG通路分析结果对康艾注射液活性成分抗乳腺癌靶点进行KEGG分析，取P＜0.01，共获得通路共104条，主要涉及癌症途径、TNF、HIF-1、PI3K-Akt、凋亡途径、NOD样受体、T细胞受体等信号通路。KEGG分析结果表明康艾注射液的作用靶点分布于不同的通路中，可通过多种通路达到治疗乳腺癌的作用。
2.7 分子对接结果从PDB中提取TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF蛋白的 人 类结构ID，分 别 为3Q05、3OS5、1JUN、6SLG、2AZ5，将其与配体isorhamnetin、quercetin、kaempferol、oxymatrine分别进行对接分析，结果见表3。结合能小于-5.0 kcal∕mol，表示对接形成的结构较稳定［13］。结果显示，配体和受体可以自发进行结合，其中AKT1-isorhamnetin、ATK1-oxymatrine、TNF-kaempferol、TNF-oxymatrine、TP53-oxymatrine、TP53-quercetin、TP53-kaempferol具有较强的结合，结合能均小于-6.0 kcal∕mol。以TP53-quercetin（7a）、TP53-kaempferol（7b）的对接结果为例进行展示，TP53与quercetin通过氨基酸残基TYR-233、PRO-98、VAL-97、TYR-229、GLU-221产生氢键相互作用，与kaempferol通过氨基酸残基TYR-233、TYR-229、GLU-221、VAL-97产生氢键相互作用，从而产生稳定的结合，如图3所示。
表3 康艾注射液活性成分与靶点蛋白间的结合能∕（kcal∕mol）
乳腺癌是当今世界面临的重大公共卫生问题，对人类身心健康产生巨大威胁。2020年，我国乳腺癌新发病例约42万例，死亡约12万例，发病增速高于全球水平，情况不容乐观［2］。康艾注射液含有黄芪、人参和苦参素，三种成分均具有抗癌功效。其中黄芪提取物对MCF-7等三种乳腺癌细胞均具有增殖抑制作用［14］，人参皂苷对Luminal型乳腺癌大鼠肿瘤生长效果良好［15］，氧化苦参碱通过分泌型糖蛋白∕β-连环蛋白（Wnt∕β-catenin）通路对人乳腺癌MCF-7细胞干预作用［16］。虽然康艾注射液治疗乳腺癌疗效明显，但其抗癌的分子机制尚未明确，本研究对康艾注射液治疗乳腺癌的机制进行网络药理学分析，并利用分子对接技术进行验证。
以生物利用度和类药性为考察指标，从康艾注射液中筛选出异鼠李素、槲皮素、山柰酚、氧化苦参碱等共32个抗乳腺癌活性成分。其中异鼠李素属于黄酮类化合物，研究发现异鼠李素可显著抑制乳腺癌MCF-7及BT-549细胞株增殖，降低AKT和细胞外调节蛋白激酶（ERK）的磷酸化及Ki67的表达，并引起细胞的凋亡［17］；
也能通过介导AKT和丝裂原活化的细胞外信号调节激酶（MEK）达到抗乳腺癌的效果［18］。槲皮素属于黄酮醇类化合物，可以结合整合 素β3（Integrin β3），促使基 质金属蛋 白 酶-2（MMP-2）等蛋白表达下调，从而抑制TNBC的侵袭迁移［19］；
也可以通过靶向抑制特异性蛋白5∕跨膜糖蛋白1型（GAS5∕Notch1）信号通路促进MCF-7细胞凋亡［20］。山柰酚也是一种天然黄酮，能够抑制MDA-MB-231细胞的活力，阻滞G2∕M期，诱导凋亡和DNA损伤，增加磷酸化组蛋白（γH2AX）、活化胱天蛋白酶9（cleaved caspase-9）、活化胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）和酸化毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白（p-ATM）的表达水平［21］；
可以在体外通过调控Notch1、cleaved caspase-3蛋白来抑制SKBR-3细胞增殖并诱导凋亡［22］。氧化苦参碱属于苦参型生物碱，对TNBC细胞生长和迁移侵袭有抑制作用，具有潜在的抗肿瘤生长和转移作用［23］；
还可以抑制Wnt∕β-catenin通路促进MCF-7细胞凋亡［24］。
经康艾注射液和乳腺癌共有靶点交集筛选出TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF等共125个关键靶点。其中TP53在癌症中多发生突变，结果导致DNA损伤修复途径的异常、细胞周期的停滞、染色质重塑和细胞凋亡［25］。TP53是重要的癌症标志物，在30%的乳腺癌中观察到TP53突变。AKT1参与细胞生长、分化、凋亡和迁移等过程，是治疗乳腺癌的潜在靶点［26］；
也可介导β-catenin核转位对MCF-7细胞迁移产生负调控作用［27］。原癌基因蛋白∕活化蛋白1（c-Jun）参与乳腺癌的发生、发展和转移过程，并与增殖和血管生成有关［28］，药物激活c-Jun可以通过蛋白激酶C途径抑制MCF-7细胞的增殖［29］。miR-198可靶向作用于乳腺癌细胞中MAPK1，从而抑制细胞的凋亡［30］。TNF-α可作用于乳腺癌中酸性鞘磷脂酶（ASM）等蛋白来调控的细胞增殖［31］；
也能促进乳腺癌细胞由G0∕G1期向S期转化，使细胞进入到对化学药物治疗敏感的增殖周期［32］。
经GO功能分析获取炎症反应、细胞核、染色质结合等411条生物学过程。经KEGG通路分析获取括癌症通路、TNF、HIF-1、PI3K-Akt、凋亡通路、NOD样受体、T细胞受体等104条通路。其中tmTNF-α在乳腺癌中高表达，可以使核转录因子κB（NF-κB）活化，tmTNF-α-NF-κB通路与乳腺癌耐药有关，tmTNF-α可能成为耐药性乳腺癌新的治疗思路和治疗靶点［33］；
同时TNFR高表达可激活NF-κB通路诱发细胞亡［34］。PI3K-Akt通路过度激活与人表皮生长因子受体2（HER2）治疗耐药相关［35］，PI3K和AKt的表达上调可诱导淋巴管生成及淋巴转移［36］。研究发现，敲除高表达的泛素特异性蛋白酶21（USP21）可以抑制TNBC的迁移和侵袭，显著下调参与NOD样受体信号通路的多个基因表达［37］。最后，分子对接结果显示药物分子与受体蛋白可以通过氢键等作用力进行结合，表明康艾注射液可以作用于上述靶点对乳腺癌产生作用。
综上所述，本研究对康艾注射液治疗乳腺癌的药效物质基础及相关机制进行了网络药理学预测分析，发现异鼠李素、槲皮素、山柰酚、氧化苦参碱等活性成分，可作用于TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF等靶点，介导癌症、TNF、HIF-1、PI3K-Akt等信号通路，从而为深入研究康艾注射液治疗乳腺癌的机制提供了理论依据。后期可探讨分子之间的协同用药以及靶点之间的相互作用模式，为后续研究康艾注射液抗乳腺癌的分子机制研究奠定基础。
（本文图1～3见插图1-1）
图1 “药物-成分-靶点-疾病”相互作用的网络图 图2 康艾注射液治疗乳腺癌靶点蛋白相互作用网络图 图3 康艾注射液分子对接图：3A为TP53-quercetin；
3B为TP53-kaempferol
