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陈泓臻 邱惠芳
胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor,GIST）是胃肠道常见间叶组织源性肿瘤，好发于胃及小肠，可累及整个消化道，占消化道肿瘤的5%[1]。GIST多伴有血小板源性生长因子α多肽（platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRα）和 v-kitHardy-Zucker-man4猫科肉瘤病毒致癌基因同源物（v-kitHardy-Zuckerman4 of oncogene homolog,KIT）基因的获得性功能突变，表现为KIT蛋白（CD117）特异性阳性表达[2-3]。GIST生物学行为极为复杂，危险度分级与患者预后情况受多种因素综合影响[4-5]，危险度分级作为预后、靶向治疗及治疗年限选择的评估依据不够完备，除经典的核分裂象计数、肿瘤最大直径、转移及破裂等预后指标外，分子生物学标志物在评估患者进展效能和生存风险等方面也广受关注。Ki-67是一种反映细胞分裂与增殖活性的核抗原，其高表达与恶性肿瘤分化、浸润、转移及不良预后密切相关，作为一种可靠的预后标志物，已应用于肺癌、神经鞘瘤、口腔癌及胰腺神经内分泌肿瘤的预后评估[6-7]。钙激活通道蛋白1（calcium activated chloride channel1,ANO1）又称DOG-1蛋白，与Ⅲ型酪氨酸激酶受体信号传导通路有关，可选择性高表达于GIST，尤其是KIT蛋白表达阴性GIST患者，能够有效反映GIST病情进展，对预后评估有潜在应用价值[8]。目前，Ki-67与DOG-1对GIST预后的预测评估作用尚存争议，两者与GIST预后的关系尚待进一步验证。为此，本研究选取107例GIST患者作为回顾性队列，探讨了Ki-67抗原和DOG-1表达水平与预后的关系，以期为临床评估GIST患者病情进展及预后情况提供依据。
1.1 对象 选取杭州师范大学附属医院2018年1月—2021年12月收治的107例GIST患者作为回顾性队列研究对象。其中男65例，女42例；
年龄25～73（57.53±9.87）岁；
肿瘤部位：胃67例，肠道40例；
肿瘤直径 1～26（6.58±4.50）cm；
肿瘤转移部位：肝转移 9例，脾转移2例，腹盆腔多发转移1例。纳入标准：符合《中国胃肠间质瘤诊断治疗共识（2017年版）》[9]的GIST诊断标准，并经病理学检查确诊；
免疫组化、临床诊疗及随访资料完整。排除标准：手术治疗前接受化疗、放疗、靶向治疗者；
病理诊断不明确者；
合并其他严重系统性疾病者。收集患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、肿瘤转移与否、核分裂象计数、美国国立卫生研究院（National Institutes of Health,NIH）危险程度分级等资料数据。本研究符合世界医学协会《赫尔辛基宣言》的要求。
1.2 方法
1.2.1 Ki-67和DOG-1表达水平的检测 采用EnVison两步染色法。获取患者经内镜下或外科手术切除后的标本，以含10%甲醛的饱和碳酸钙溶液固定，脱水后用石蜡包埋，切片，经过柠檬酸修复液处理，用蒸馏水与PBS缓冲液冲洗后滴加一抗，过夜后再次冲洗；
加二抗，37℃孵育后冲洗，进行显色、封片处理，显微镜下观察。所用抗体Ki-67和DOG-1均购自中国北京中杉金桥生物技术开发有限公司。以PBS代替一抗作为阴性对照，以试剂盒配套试剂为阳性对照。
1.2.2 结果判定 由2名主治病理医师共同判读。细胞核呈棕黄色判定为Ki-67阳性表达，选取10个高倍视野（high power field,HPF），统计阳性细胞数占总细胞数的比例并取平均值，＞10%为高表达，≤10%或未染色为低表达。统计细胞质或细胞膜染色的细胞数占总细胞数的比例并取平均值，＞10%为DOG-1阳性表达，≤10%或未染色为阴性表达。
1.2.3 危险程度分级 采用NIH专家组制定的原发GIST手术治疗后危险度分级标准，选择肿瘤细胞生长最活跃区域，连续观察50个HPF进行核分裂象计数，结合肿瘤大小、肿瘤部位及肿瘤破裂进行综合评估，分为极低危、低危、中危和高危4级[10]。
1.2.4 随访 术后随访时间4～50个月，中位随访时间31个月，统计随访时间内累积生存率。
1.3 统计学处理 使用SPSS22.0统计软件，计数资料用频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法绘制不同Ki-67和DOG-1表达水平GIST患者的生存曲线并计算累积生存率，采用ROC曲线分析Ki-67和DOG-1水平对GIST患者预后的预测效能。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 Ki-67和DOG-1表达与GIST临床病理特征的关系 Ki-67高表达和DOG-1阳性表达与肿瘤直径、肿瘤转移、核分裂象计数、NIH危险度分级密切相关（P＜0.01），见表1。
表1 Ki-67和DOG-1表达与GIST临床病理特征的关系[例（%）]
2.2 Ki-67、DOG-1表达与GIST患者累积生存率的关系 Kaplan-Meier生存曲线分析显示，Ki-67低表达GIST患者累积生存率高于高表达患者，DOG-1阴性表达患者累积生存率高于阳性患者，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1。
图1 Ki-67和DOG-1表达水平与GIST患者累积生存率的关系
2.3 Ki-67、DOG-1水平对GIST患者预后的预测效能 ROC曲线显示，Ki-67最佳截断值为15.87%，Ki-67表达对GIST预后预测的AUC为0.847（P＜0.01）；
DOG-1最佳截断值为12.58%，DOG-1表达对GIST预后预测的AUC为0.940（P＜0.01），见图2。
图2 Ki-67和DOG-1水平预测GIST患者预后的ROC曲线
手术切除是原发性GIST的主要治疗手段，但术后复发率依然较高，因此，准确、个性化的危险度分级是手术治疗后治疗年限选择和靶向治疗方案评估的关键，直接决定了患者预后程度。现行广泛使用的NIH危险度分级标准基于2002年NIH标准肿瘤最大直径和核分裂象计数，同时吸收美军病理学研究所标准中肿瘤部位、引入肿瘤破裂等评估参数改良而成，大大提高了GIST预后风险分级的准确性和实用性[11]。但是大量研究表明，NIH危险度分级标准并不适用于所有GIST的生物学行为及临床转归评估，一小部分GIST可快速进展致肝转移，亦不乏大量高危GIST患者即便术后不接受辅助治疗却依然长期保持无病生存[12-15]。这充分说明了GIST生物学行为的复杂性，患者个体巨大的异质性与NIH危险度分层之间的匹配度不完备，导致NIH危险度分级在临床实践中既容易忽视高危GIST群体的内部差异，又容易放大极低危与低危GIST群体间差异。因此，NIH危险度分级标准对GIST预后、靶向治疗及治疗年限选择的评估依据依然完备性不足。改进路径无非两条，一是持续改进肿瘤最大径、核分裂象计数、肿瘤部位和肿瘤破裂这4个现有参数的评估方法，二是引入分子生物学标志物等新参数。
GIST预后相关危险因素包括肿瘤大小、核分裂数、肿瘤原发部位和肿瘤是否破裂等，尚没有特异性生物学标志物反映GIST的恶性潜能。研究发现，Ki-67与细胞增殖有关，在肿瘤组织中表达越高，肿瘤生长速度就越快，而生长速度快慢正是区分肿瘤良、恶性的一个主要特点，提示Ki-67可以作为判断GIST恶性潜能和预后的一个潜在指标[15]。Ki-67分布于细胞核内，主要表达于细胞分裂周期的M期，G1期、S期较少表达，直接与细胞有丝分裂相关，其表达水平与肿瘤细胞增殖活跃程度、侵袭转移密切相关[16]。DOG-1是11q13位点上由CCND1-EMS1基因编码的跨膜蛋白，可参与调控Ⅲ型酪氨酸激酶受体信号传递通道，可能是GIST发病的重要机制之一，在GIST中的表达率可达90%～95%[17]。Ki-67和DOG-1作为潜在的危险度分级及预后评价指标，目前已广受临床关注。本研究结果显示，Ki-67高表达和DOG-1阳性表达与GIST肿瘤直径、肿瘤转移、核分裂计数、NIH危险度分级密切相关（均P＜0.01），GIST患者累积生存率与Ki-67和DOG-1表达水平密切相关（均P＜0.05）。ROC曲线分析发现，Ki-67和DOG-1表达水平对GIST预后预测的AUC为0.847和0.940（P＜0.01），与Ghadir等[18]的结论较为接近，后者认为Ki-67标记指数（Ki-67 labeling index,Ki-67LI）与核分裂象计数具有相似的应用价值，可以作为高危GIST伊马替尼延长治疗的辅助指征。但目前相关研究分组切点值较多，尚无形成共识性的最佳分组界值。在Al-Zawi等[19]的研究中，Ki-67LI切点值为6%，其对GIST患者无复发生存率预测的AUC为0.814，仅具中等预测效能，AUC值低于本研究以10%为界值的0.847。Boilve等[20]的研究结论却相反，当Ki-67LI＞8%时，高危GIST延长使用伊马替尼的获益会明显降低。本研究Ki-67的最佳分界值为15.87%，与Soliman[21]认为Ki-67LI≥10%可以作为整体生存率及无病生存率较差的独立预测因子的研究结果较为一致。本研究表明，DOG-1阳性表达的GIST患者预后更差，累积生存率更低。但是Li等[22]通过一个多中心研究证明，DOG-1和CD117阳性与不同危险度分级之间无明显相关性，不能作为预测GIST危险度的指标。另外，Akbari等[23]的一个大规模研究显示，血清DOG-1检测可以有效反映GIST患者病情进展，手术治疗后血清DOG-1水平显著下降或呈阴性，疾病一旦进展或复发转移，血清DOG-1便立即升高或转阳，因此血清DOG-1检测也被形象地称为“液体活检”。总之，DOG-1能否用于预后评估和纳入危险度分级尚存争议，Ki-67要想获得与传统核分裂象计数同等地位或取而代之，亦需进一步大样本、前瞻性的研究作为循证依据。
综上所述，Ki-67和DOG-1对GIST预后分别具有中等和较高预测效能，可作为重要预后影响因子，结合核分裂象计数和NIH危险度分级综合评估患者预后，可增进患者获益。但是，本研究样本量小、随访时间短，加之目前有关Ki-67和DOG-1对GIST预后评估多为单中心研究，尚需更多大样本、多中心、前瞻性、长时段的研究作为循证依据，才能判定是否将Ki67和DOG-1纳入危险程度分层，进一步改进NIH危险度分级标准，增加其准确性和实用性。
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