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韦雪艳 林秋伶 邱模勤 陈佩琴 周子寒 刘颖春梁伟康 张若昕 余红平
1广西医科大学公共卫生学院（南宁 530021）；
2广西医科大学附属肿瘤医院（南宁 530021）；
3复旦大学公共卫生学院流行病学教研室（上海 200032）
原发性肝癌（简称肝癌）发病率和死亡率分别居于恶性肿瘤第6位和第3位[1]。广西的肝癌死亡率居广西肿瘤死因谱首位[2]。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝癌的主要临床病理类型[1]，且HCC的5年总生存率仍低于 15%[3]。研究表明，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与个体疾病进展以及预后密切相关[4-5]。超级增强子（super-enhancers，SEs）是基因组中大量增强子富集的转录调控区域，能够结合转录因子，促进癌基因表达[6-7]。SEs主要负责调控决定细胞身份的基因表达，如决定癌细胞身份的致癌基因[8-9]。多项研究发现，SE区域的SNPs可通过调控致癌SEs的活性促进或抑制靶基因的表达，在肿瘤的发生发展中起重要作用[10-12]。然而，目前尚无SEs区域SNPs与HCC患者预后的研究报道。本研究探讨SEs区域SNPs与HCC患者预后之间的关系，以识别新的预后标志物，为寻找HCC的治疗靶点和个体化防治提供新思路。
1.1 病例选择及一般资料基于本课题组全基因组芯片分析数据库中来源于2007年7月至2017年12月在广西医科大学附属肿瘤医院首次确诊并行肝癌切除术的866例HBV相关HCC患者，均为HBsAg血清阳性及经病理检查或AFP等确诊为HCC。排除丙肝抗体阳性患者，远处转移或晚期患者，合并严重心脏、肺脏、肾脏及脑血管疾病和术前接受化疗和（或）放疗的患者。调查员通过查阅病历和电话随访等方式收集患者的一般情况以及随访情况，如年龄、性别、吸烟、饮酒、HBV感染状况等。统计分析时，将866例的总人群使用随机数按1∶1比例分为发现集和验证集，各433例。本研究获得广西医科大学肿瘤医院伦理委员会批准并经患者知情同意（批准号：LW2022076）。
1.2 随访按照HCC患者出院后前两年每3个月随访一次、之后每6个月随访一次的随访周期，以电话随访患者本人或其家属。以死亡为研究终点，总生存期（overall survival，OS）作为研究变量，OS定义为手术日期至死亡或末次随访日期（2020年3月）。失访或末次随访未死亡的病例作为截尾事件。
1.3 DNA提取、基因分型和质量控制本研究术前对研究对象抽取5 mL外周血，采用血液DNA提取试剂盒（恺硕生物科技（厦门）有限公司）从外周血中提取DNA。全基因组分型使用Illumina Infinium® Global Screening Assay芯片。用PLINK（v1.9）软件进行质量控制处理。SNP排除标准：（1）位于性染色体上；
（2）检出率＜ 95%；
（3）次等位基因频率（minor allele frequency，MAF）＜ 0.1%；
（4）哈迪温伯格平衡（hardy-weinberg equilibrium，HWE）P＜1×10-6。
1.4 候选SNPs筛选本研究通过检索人类超级增强子SEdb数据库中肝癌细胞系HepG2和HuH7的H3K27ac数据，鉴定了956个HCC的特异性SEs。随后，使用PLINK1.90软件提取SEs区域上的SNPs位点。SNPs筛选标准：（1）MAF ≥ 0.05；
（2）基因分型成功率≥95%；
（3）HWE P≥1.0×10-6。最终，基于RegulomeDB和HaploReg v4.2等网站进行功能预测分析，筛选具有潜在功能性SNPs位点。
1.5 统计学方法利用R4.1.0的survival和survminer包，采用Log-Rank检验和Cox比例风险模型评估患者基本特征以及不同遗传模型中SNPs与HCC患者术后OS的关系，计算风险比（hazard ratio，HR）及其 95%置信区间（confidence interval，CI），并绘制风险基因型Kaplan Meier生存曲线。利用HaploView软件进行连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）分析，并绘制LD图。
2.1 研究人群基本特征及其与HCC术后OS关系本研究共纳入866例HCC患者，截止到2020年3月，共419例（48.4%）患者发生死亡，中位生存时间（median survival time，MST）为39.05个月。Log-Rank检验发现，年龄、AFP、癌栓和BCLC分期均与HCC患者OS相关（P＜0.05）。见表1。
表1 866例HBV相关HCC患者的一般临床特征Tab.1 Clinical characteristics of 866 patients with HBV-related HCC 例（%）
2.2 超级增强子区域SNPs与HBV相关HCC患者术后OS的关系在加性模型下，利用多因素Cox比例风险回归分析并校正年龄、性别、吸烟、饮酒、AFP、肝硬化、有无癌栓、BCLC分期和主成分分析中具有统计学差异的成分等因素，并采用假阳性报告率（false positive report probability，FPRP）进行多重假设检验。在发现集筛选出与HCC患者OS相关的1 272个SNPs（P＜0.05，FPRP＜ 0.2）；
接着，在验证集中验证这1 272个SNPs位点，结果发现位于3个基因的7个SNPs位点与HBV相关HCC患者术后OS仍存在关联。见表2。
表2 与HBV相关HCC患者术后OS相关的7个SNPSTab.2 Associations between seven validated significant SNPs and postoperative OS of HBV-related HCC
2.3 筛选具有潜在功能性SNPs位点本研究对与HCC患者术后OS相关的谷氨酰胺合成酶（glutamate-ammonia ligase，GLUL）上的5个SNPs进行连锁不平衡分析，结果发现这5个SNPs高度连锁（r2＞0.9），见图1。随后，采用生物信息学工具对上述7个SNPs的进行功能注释，见表3。结果显示，轴抑制蛋白 2（axis inhibition protein 2，AXIN2）和Bcl2修饰因子（bcl2 modifying factor，BMF）rs546220预测都位于增强子区组蛋白标记处，且可能会对基序有影响；
GLUL rs61805159预测得分最高为2a，位于增强子区组蛋白标记处且可能会对9个基序有影响。最终，根据连锁不平衡分析和功能注释结果选择3个具有潜在功能性SNPs（GLUL rs61805159，BMF rs546220，AXIN2 rs4791170）进行进一步分析。
表3 7个与HBV相关HCC OS相关SNPs的功能预测Tab.3 Functional prediction of seven significant SNPs
图1 GLUL基因SNPs的连锁不平衡分析Fig.1 Linkage disequilibrium of GLUL gene SNPs
2.4 SNPs与HBV相关HCC患者术后OS的关系在不同遗传模型下（加性、显性模型）对上述3个SNPs进行多因素Cox回归分析，评估其与HBV相关HCC患者术后OS的影响。显性模型下，携带GLUL rs61805159位点GA/AA基因型的HCC患者比携带GG基因型的患者术后死亡风险增加45%（HR=1.45，95%CI：1.17 ～ 1.79，P＜ 0.001）；
携带BMF rs546220 AA/AC基因型患者较携带CC基因型HCC患者术后死亡风险降低35%（HR=0.65，95%CI：0.52～ 0.81，P＜0.001）；
与携带GG基因型的患者相比，携带AXIN2 rs4791170位点GA/AA基因型的患者术后死亡风险增加43%（HR=1.43，95%CI：1.17～ 1.74，P＜ 0.001）。见表4。
表4 3个相关的SNPs的遗传模型分析Tab.4 Different genetic model analyses of three SNPs
2.5 SNP-SNP联合作用对HBV相关HCC患者术后OS影响考虑到各SNP之间在HCC发生发展中可能存在潜在联合作用，本研究将rs61805159位点GA/AA基因型、rs546220位点CC基因型、rs4791170位点GA/AA基因型定义为假设危险基因型（简称危险基因型），进一步分析SNPs联合作用对HBV相关HCC患者术后OS的影响。多因素Cox回归分析结果显示，相比于携带0个风险基因型的患者，携带1、2或3个风险基因型的患者术后死亡风险更高，预后更差，且死亡风险随着风险基因型的个数增加而增加（Ptrend＜0.001），见表5。同时，Kaplan-Meier分析发现与携带0个风险基因型的患者相比，携带1、2或3个风险基因型的患者MST更短（MST分别为 103.8、74.5、51.3、24.4个月），且MST随着风险基因型的个数增加而缩短，P＜ 0.001（图2）。
图2 联合风险基因型与HCC患者OS关系的KM曲线Fig.2 Kaplan-Meier curves of combined risk genotypes and OS of HCC
表5 联合风险基因型与HBV相关HCC患者术后OS的相关性Tab.5 Correlation analysis of combined risk genotypes with postoperative OS of HBV-related HCC
本研究探讨超级增强子区域SNPs与HBV相关HCC患者术后OS关系。单位点分析中，GLUL rs61805159和AXIN2 rs4791170的A等位基因均可增加患者术后的死亡风险，BMF rs546220 A等位基因降低患者术后的死亡风险；
SNPs联合作用分析发现，这3个SNPs的联合作用影响HCC患者术后的OS，携带风险基因型的个数越多，其OS越短，存在明显的剂量反应关系。以上结果提示超级增强子区域SNPs与HBV相关HCC患者术后预后有关。
研究发现，单个SNP位点对肝癌发生发展作用微小，而多位点的联合作用往往在肿瘤的发生发展过程中发挥更大的作用[13-14]。WANG等[15]对rs567403和rs7969508的风险基因型联合分析发现，与携带0-1个不利风险基因型相比，携带2个不利风险基因型的皮肤黑色素瘤患者发生死亡的风险增加了2.17倍。本研究发现与携带0个风险基因型患者相比，携带多个风险基因型的患者发生死亡的风险增加，提示rs61805159 GA/AA、rs546220 CC和rs4791170 GA/AA位点的联合作用可协同增加HBV相关HCC术后患者的死亡风险，且HCC术后患者OS明显缩短，提示其不利风险基因型对HCC患者预后存在显著的累加效应。
GLUL具有催化谷氨酰胺的功能，在维持细胞酸碱稳态以及氨解毒，细胞信号传导和增殖过程也发挥重要的作用[16]。据报道，体外敲低GLUL可有效抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[17]，上调GLUL能促进乳腺癌细胞增殖[18]，还是多形性胶质母细胞瘤患者的不良预后标志物[19]。上述研究提示，GLUL可能参与HCC发生发展，进而影响HCC患者的预后。本研究发现携带rs61805159 AA和GA基因型的HBV相关HCC患者比携带GG基因型的患者有较短的OS。功能注释分析发现rs61805159 G＞A位于超级增强子区域，可能会引起基序改变。因此，笔者推测rs61805159 A等位基因可能通过提高增强子活性来促进GLUL表达，从而增加HCC患者死亡风险。
BMF属于Bcl2家族的成员，其形成的异质或同源二聚体，可以作为参与各种细胞活动的抗凋亡或促凋亡调节剂[20]。KANDASWAMY等[21]发现在慢性淋巴细胞性白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）中，rs539846（C ＞A）A等位基因能够降低BMF的表达，减少肿瘤细胞凋亡，从而增加CLL易感性。JIANG等[22]发现上调miR-640可以通过靶向抑制BMF基因促进胶质母细胞瘤细胞增殖。在本研究中，BMF rs546220位点A等位基因可降低HBV相关HCC患者术后的死亡风险，延长患者的生存时间。功能预测分析表明，BMF rs546220位于超级增强子区域，可能对基序改变发挥作用，提示rs546220 A等位基因可能发挥促进增强子的作用来上调BMF mRNA表达，进而调控HCC的生物学过程，并改善HCC患者的术后生存情况。
AXIN2是Wnt/β-catenin信号通路中的关键调节因子，在细胞生长、许多恶性肿瘤的发生、肿瘤进展等方面起着重要作用。研究发现，AXIN2是一个促癌启动子，它可以上调转录抑制因子Snail的活性诱导上皮间质转化，从而促使肿癌细胞发生转移，导致肿瘤不良预后[23-24]。ROSALESREYNOSO 等[25]研究发现，携带 AXIN2 rs2240308（C＞T）T等位基因个体罹患乳腺癌的风险显著增加。在本研究中，AXIN2 rs4791170 A等位基因与HBV相关HCC患者预后较差相关，这可能与激活Wnt/β-catenin信号通路，上调AXIN2表达，进而促进肿瘤细胞转移与侵袭相关。
综上，本研究发现携带GLUL rs61805159 GA/AA、BMFrs546220CC和AXIN2rs4791170GA/AA风险基因型的HBV相关HCC患者术后OS更差。然而，对于这些SNPs的作用机制尚未能完全阐明，需要今后进一步深入开展SNP功能学研究进行解析。本研究的局限性是样本量相对较小，在一定程度上可能影响了检验效能；
其次未能收集患者术后治疗信息，可能对结果产生一定的影响。因此，本研究需要更大样本量的研究进一步验证。
