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马文礼，马小娟，马娟弟，张红霞，杨帆，王丽新
糖皮质激素因其显著的调节免疫、抗炎、美白等作用，被广泛用于多种皮肤病的治疗。长期应用后停药易诱发停药反应，表现为皮肤红斑、痤疮、脱屑，并伴有刺痛、烧灼、瘙痒等不适，恢复用药后皮损可缓解，使患者身体及心理产生依赖，严重影响患者身心健康[1]。皮肤屏障分布于皮肤最外层，作为机体与外界环境隔离的最关键结构，对维持机体内环境稳态和抵御外来物质的侵袭具有重要作用。兜甲蛋白(LOR)作为皮肤屏障最主要蛋白，其含量占角质层总蛋白80%，另一关键蛋白质丝聚蛋白(FLG)经半胱氨酸蛋白酶-14(Caspase-14)切割分解为游离氨基酸，为皮肤提供天然保湿因子，维持皮肤水分[2]。HDD的特征性表现为皮肤屏障相关蛋白的破坏，随着皮肤屏障破坏，角质形成细胞衍生的炎症级联反应启动，辅助性T细胞和嗜酸性粒细胞增多[3]。
紫草油为皮肤科常用制剂，临床报道其对多种皮肤病疗效显著[4]，但目前对其作用机理的研究尚匮乏。本研究以紫草油对HDD豚鼠进行干预，从调节免疫和皮肤屏障修复机理角度探讨其作用机理，为临床用药提供理论支撑。
1.1材料
1.1.1动物 健康2月龄雌性白化豚鼠32只，体重(330±20)g，购自宁夏医科大学实验动物中心[许可证号：SYXK(宁)2020-0001]。实验研究已通过宁夏医科大学动物伦理委员会审查(批准代码：IACUC-NYLAC-2021-053)。
1.1.2药品 丙酸氯倍他索粉剂(中国食品药品检定研究院，批号：100302-201804)。0.03%他克莫司软膏(浙江万晟药业有限公司)。紫草药材(宁夏明德中药饮片有限公司，批号：20210201)。芝麻油(上海太太乐食品有限公司)。
1.1.3试剂 IL-4(JL21520)、IFN-γ (JL11665)、IgE(JL11287)ELISA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)。FLG(美国Affinity，DF13653)；
LOR(美国Thermo Fisher Scientific)；
Caspase-14(美国Novus)。0.25%胰酶蛋白消化液(北京索莱宝科技有限公司，T1350)；
山羊抗兔的二抗、山羊抗鼠的二抗、DAB显色剂、ECL发光试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZB2301、ZB2305、ZLI-9018、SC-2048)。
1.1.4实验仪器 超微量紫外可见分光光度计DS-11(美国丹诺尔)；
BP310P型称量天平(德国Sartorius公司)；
Centrifuge5417R型低温高速离心机(德国Eppendorf公司)。
1.2方法
1.2.1紫草油制备 取紫草药材适量，粉碎，以10倍量芝麻油浸泡药材1 h后，145 ℃高温加热1 h后，放置冷却即得[5]。
1.2.2HDD豚鼠模型建立 32只豚鼠分别于背部左右两侧选取5 cm×5 cm区域脱去毛发。随机选取8只豚鼠作为空白组，右侧涂抹75%酒精，左侧涂抹生理盐水，剩余24只右侧涂抹0.05%丙酸氯倍他索酊剂[6]，左侧涂抹75%乙醇， 2次/d，连续7周。
1.2.3分组及给药 将上述24只HDD模型豚鼠随机分3组，即模型组、治疗组、阳性对照组。模型组右侧皮肤涂抹生理盐水，治疗组右侧皮肤涂抹紫草油，阳性对照组右侧皮肤涂抹0.03%他克莫司软膏， 2次/d，连续3周。
1.2.4皮脂测试仪、皮肤镜及红外成像系统检测 使用皮脂检测仪、皮肤镜分别对上述4组豚鼠双侧皮肤于治疗前、治疗后进行检测，对皮肤水分、油分重复检测3次，取均值作为皮肤水分、油分值；
皮肤镜采集皮肤组织图像；
红外成像系统测量双侧皮温。
1.2.5样本采集 于末次给药12 h后,以3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后，心尖取血，3 500 r/min条件下离心15 min，取上清液用冻存管分装后，置-80 ℃冰箱保存。取豚鼠双侧脱毛区完整皮肤，部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余部分用冻存管分装后，置-80 ℃冰箱保存。
1.2.6血清炎症因子检测 取1.2.5中上清液，参照ELISA试剂盒说明对血清IL-4、IFN-γ、IgE水平进行检测。
1.2.7皮肤组织病理性检测 取1.2.5中4%多聚甲醛溶液固定后组织，经常规脱水、石蜡包埋、切片(厚度为5 μm)，HE染色后封片，置于光学显微镜下观察(×200)。
1.2.8免疫组织化学检测皮肤组织FLG、LOR和Caspase-14蛋白表达 将切片常规脱蜡至水、经抗原高压修复、孵育、血清封闭、滴加PBS稀释后的一抗，湿盒内 4 ℃孵育过夜、PBS洗涤3次，5 min/次、滴加HRP标记的二抗，室温孵育 30 min、同法洗涤3次、滴加新配的DAB显色液显色、苏木素复染细胞核、脱水封片、镜下观察采图(×400),细胞核为蓝色，阳性表达为棕黄色。
1.2.9Western blot法检测皮肤组织FLG、LOR和Caspase-14表达 将皮肤组织放入0.25%胰酶蛋白消化液中4 ℃浸泡16 h后，轻轻揭下表皮层，称取50 mg剪碎，于液氮中研磨至细粉状，分装至离心管，加入RIPA裂解液500 μL，混匀，4 ℃放置过夜后，12 000 r/min，4 ℃条件下离心10 min，取上清液。运用超微量紫外可见分光光度计测定蛋白浓度，95 ℃条件下变性10 min。于SDS-PAGE凝胶上样后电泳，PVDF转膜，5%脱脂奶粉室温下封闭 2 h，加入PBS稀释后的一抗，4 ℃过夜。PBST液洗涤3次，10 min/次。加入PBST稀释后的二抗，作用90 min，同法洗涤后，暗盒中采用ECL法显影，扫描胶片，Image-J软件测定条带灰度值。
2.1各组豚鼠皮肤水分、油分含量及皮温比较 与空白组相比，模型组水分、油分含量显著降低，皮温升高(P< 0.05)；
与模型组相比，紫草油组、他克莫司组水分、油分升高，皮温降低(F水分=11.92、F油分=13.29、F皮温=7.95，P<0.05)，见表1。
表1 各组豚鼠水分、油分及皮温比较Tab.1 Comparison of water content, oil content and skin temperature of guinea pigs in each n=8)
2.2各组豚鼠皮肤镜特征 与空白组相比，模型组豚鼠皮肤可见毛细血管扩张，表面散在鳞屑覆盖；
与模型组相比，紫草油及他克莫司组可见鳞屑消退，毛细血管扩张改善(图1)。
Normal group; Model group; Lithospermum oil group; Tacrolimus group图1 各组豚鼠皮肤镜特征Fig.1 Dermoscopy characteristics of guinea pigs in each group
2.3各组豚鼠皮肤组织形态学变化 与空白组相比，模型组豚鼠表皮角质层角化不全，表皮增生，棘层肥厚，表皮突下延呈杵状，真皮浅层致密的炎症细胞浸润(黄色箭头示)；
与模型组相比，紫草油组及他克莫司组角质层增厚，表皮增生及真皮浅层炎症细胞浸润改善(图2)。
Normal group; Model group; Lithospermum oil group; Tacrolimus group图2 各组豚鼠皮肤组织病理 (HE×200)Fig.2 Histopathology of skin tissue of the guinea pigs in each group (HE×200)
2.4各组豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE水平变化 与空白组相比，模型组豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；
与模型组相比，紫草油组、他克莫司组豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE水平均降低，差异有统计学意义(FIL-4=51.49、FIFN-γ=22.12、FIgE=17.96，P<0.05)，见表2。
表2 各组豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE水平变化Tab.2 Changes of IL-4, IFN-γ and IgE levels in serum of guinea pigs in each
2.5各组豚鼠表皮组织FLG、LOR和Caspase-14蛋白表达情况 免疫组织化学结果示，FLG、LOR和Caspase-14主要表达于表皮角质层、颗粒层以及真皮层毛囊周围(图3)。Western blot法检测结果示(图4)，较之于空白组，模型组表皮组织FLG、LOR和Caspase-14表达显著下调(P<0.01)；
较之于模型组，紫草油组及他克莫司组FLG、LOR和Caspase-14表达显著上调(FFLG=118.69、FLOR=52.88、FCaspase-14=32.45，P<0.01)。
图3 各组豚鼠表皮组织FLG、LOR和Caspase-14免疫组织化学结果 (×400)Fig.3 Immunohistochemical results of FLG, LOR and Caspase-14 in guinea pig epidermis of each group (×400)
Note:1 indicated Normal group; 2 indicated Model group; 3 indicated Tacrolimus group; 4 Lithospermum oil group; Compared with normal group,# P<0.05,##P<0.01;compared to model group,*P<0.05, **P<0.01. Electropherogram of FLG, LOR and Caspase-14 expression in guinea pig epidermis of each group; FLG expression result; LOR expression result; Caspase-14 expression result图4 Western blot法检测各组豚鼠表皮组织FLG、LOR和Caspase-14表达结果Fig.4 Western blot method to detect the expression of FLG, LOR and Caspase-14 in guinea pig epidermis of each group
HDD的发病机制目前尚不完全清楚，但主要认为与皮肤屏障破坏有关。长期外用糖皮质激素使正常表皮分化受抑制，总蛋白和微丝蛋白等合成减少，最终引起皮肤屏障功能缺陷[3]。本研究结果显示，经丙酸氯倍他索局部外用7周后，模型成功建立，表皮组织相关屏障蛋白FLG、LOR和Caspase-14等被下调，经皮肤失水量(TEWL)增加。
HDD急性损伤期的特征是 Th2 型细胞因子及IgE抗体的过度表达[7-8]，IL-4为经典的Th2 型细胞因子，将Th0 细胞转化为 Th2 细胞，并诱导IgE抗体合成，致使机体抵抗力降低；
研究[9]表明，皮肤干燥、脱屑等也与IL-4过度表达存在相关性。IFN-γ是一种经典的Th1 型细胞因子，在HDD损伤后期，IFN-γ等Th1 型细胞因子大量分泌，进一步促进炎症反应及皮肤损伤[10]；
有研究[11]显示，药物过敏患者血清IFN-γ可过度表达。因此，IL-4、IgE和 IFN-γ水平可作为皮肤炎症严重程度的评估指标。本研究中HDD豚鼠经停用激素制剂后，血清IL-4、IgE和 IFN-γ水平较空白对照组显著升高。
本研究结果显示，HDD豚鼠模型表皮增生，角质层出现角化不全，表皮相关蛋白表达降低，这可能与炎症级联反应的形成有关。IL-4、IFN-γ可诱导HDD角质形成细胞的凋亡增加而损伤皮肤屏障，降低表皮中FLG、LOR和Caspase-14的表达，不断加重皮损程度和延长皮损持续时间，引起表皮增厚及角化不全[12]。
紫草油是将紫草以麻油等作为溶剂所提取的一种药物剂型，因其具有抗炎、抗过敏、调节免疫作用，对多种皮肤病疗效显著[4]。现代研究[13]发现，紫草具有抗菌、抗炎、抗氧化、调节免疫等多重药理作用。吴金环等[14]报道，紫草素作为紫草主要活性成分，能够降低特应性皮炎小鼠血清IL-4表达，减轻皮损处炎症反应，其机制可能与抑制TSLP/OX40L通路有关。紫草素还可降低血清IFN-γ及IgE而发挥抗炎作用[15]。
本课题采用紫草油对HDD豚鼠进行干预，发现其可不同程度降低HDD豚鼠血清IL-4、IgE和 IFN-γ水平，这与上述研究中紫草的抗炎功能相一致。紫草油还可增强表皮组织中FLG、LOR和Caspase-14的表达，促进皮肤屏障的形成，其作用机制可能与改善皮肤炎症状态有关。
综上所述，紫草油可以抑制皮肤炎症反应的发生，改善表皮增生，恢复受损的皮肤屏障相关蛋白的表达，降低TEWL，可为HDD的治疗提供新思路。
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