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史春桃，程 杰，刘 慧，单永锋，王昊楠△
(1.无锡市锡山人民医院普外科，江苏无锡 214000；
2.无锡市第五人民医院肿瘤科，江苏无锡 214000)
结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，因其高死亡率严重危害人类的生命健康[1]。新型生物标志物的挖掘为预测和改善结直肠癌患者预后带来了可能[2]。SPOCK1是一种首次从人类睾丸中分离出来的蛋白多糖，属于一个新的Ca2+结合蛋白多糖家族，其高表达在促进结直肠癌发生、发展中具有重要意义[3-4]。有研究发现，SPOCK1能通过调控基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)水平在疾病的发生中发挥重要作用，其中包括促进恶性肿瘤的侵袭与转移[5-6]。因此，本研究旨在分析SPOCK1、MMP11与MMP9在结直肠癌组织和正常组织中的表达及相关性，评估三者单独与联合检测在评估结直肠癌临床病理特征中的价值。
1.1 标本来源
选取2012年1月至2019年12月于无锡市锡山人民医院行结直肠癌根治术的70例患者，年龄(66.17±12.29)岁，男女比例为1∶1.12。所有患者术前均未接受任何放化疗，术后病理结果经2名以上病理医师确认，并有完整的临床病例资料。
1.2 主要试剂
兔抗人SPOCK1多克隆抗体(ab229935)、兔抗人MMP11多克隆抗体(ab119284)及兔抗人MMP9单克隆抗体(ab76003)购自英国Abcam公司；
SP试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1数据库分析
本研究选取TIMER2.0和GEPIA数据库检测SPOCK1与MMPs在结直肠癌组织中的表达及相关性。利用TIMER数据库分析SPOCK1与MMPs表达在恶性肿瘤中的相关性，挑选出与SPOCK1表达呈正相关的MMPs；
运用GEPIA数据库分析MMPs在结直肠癌组织与正常组织中的表达差异，并分析SPOCK1与MMPs表达相关性。
1.3.2免疫组织化学法检测SPOCK1、MMP11及MMP9表达
采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP法)检测SPOCK1、MMP11及MMP9表达。将切片脱蜡水化、高温高压抗原修复。然后滴加Solution A液室温孵育10 min，PBS充分淋洗，再滴加Solution B液室温孵育10 min后甩干。配制一抗工作液，SPOCK1与MMP11抗体稀释度为1∶100，MMP9抗体稀释度为1∶1 000。滴加适量一抗工作液，孵育切片标本过夜后PBS淋洗。滴加Solution C液室温孵育10 min，再滴加Solution D液室温孵育10 min，PBS 充分淋洗。DAB显色，镜下观察后复染、脱水、封片。
1.3.3结果判定
免疫组织化学染色结果基于染色强度和阳性细胞数两项指标。染色强度分级评分：0分，无着色；
1分，弱染色；
2分，中等染色；
3分，强染色。阳性细胞数比例评分：0分，阳性细胞0；
1分，阳性细胞<25%；
2分，阳性细胞25%～<50%；
3分，阳性细胞50%～75%；
4分，阳性细胞>75%。染色评分(immunoreactive score，IRS)=染色强度评分×阳性细胞数比例评分，总分<4分为阴性，≥4分为阳性。
1.4 统计学处理
2.1 临床样本分析SPOCK1在结直肠癌组织与正常组织中的表达
SPOCK1主要位于细胞质内，并且在结直肠癌组织中的表达明显高于正常组织(t=7.319，P<0.001)，见图1。
A：SPOCK1在结直肠癌组织中的表达；
B：SPOCK1在结直肠正常组织中的表达；
C：SPOCK1在结直肠癌组织与正常组织中的表达差异分析。
2.2 数据库挖掘结直肠癌组织中与SPOCK1表达相关的MMPs
TIMER 2.0数据库分析发现，包括MMP1、MMP2、MMP9等13种MMPs在结直肠癌中与SPOCK1表达呈正相关，见图2。GEPIA数据库分析发现，仅有5种MMPs在结直肠癌组织中表达明显高于正常组织，包括MMP1、MMP7、MMP9、MMP11和MMP12，且与SPOCK1表达均呈正相关，见图3。结合2个数据库分析，最终确定MMP11和MMP9在结直肠癌组织中表达与SPOCK1最为密切。
图2 TIMER2.0数据库分析 SPOCK1与MMPs表达相关性
2.3 临床样本分析SPOCK1、MMP11与MMP9表达相关性
MMP11与MMP9均表达在细胞质内(图4A)，且在结直肠癌组织中的表达明显高于正常组织(P<0.001，图4B)。二者均与SPOCK1表达呈正相关，且二者之间也呈正相关(图4C)。
图3 GEPIA数据库分析结直肠癌组织中5种MMPs与SPOCK1表达相关性
2.4 SPOCK1、MMP11、MMP9表达与结直肠癌临床病理学参数的关系
根据免疫组织化学结果将70例患者进行分组：SPOCK1阳性组54例，阴性组16例；
MMP11阳性组50例，阴性组20例；
MMP9阳性组49例，阴性组21例。结合临床病理特征分析发现，SPOCK1表达与淋巴结转移、TNM分期相关(P<0.05)；
MMP11表达与肿瘤直径、淋巴结转移及TNM分期相关(P<0.05)；
MMP9表达与分化程度、淋巴结转移、TNM分期相关(P<0.05)，见表1。三者均阳性与结直肠癌肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移及TNM分期相关(P<0.05)，见表1。
表1 SPOCK1、MMP11与MMP9在结直肠癌中表达与临床病理参数的关系
A：MMP11和MMP9在结直肠癌组织与正常组织中的表达；
B：MMP11和MMP9在结直肠癌组织与正常组织中的表达差异分析；
C：SPOCK1、MMP11、MMP9相关性分析。
由于结直肠癌具有高发生率和高死亡率，其一直以来都在威胁着人类生命健康[7]。尽管除了手术，还有化疗、放疗、靶向治疗等多种治疗手段能够治疗结直肠癌，但许多患者在初诊时即有转移迹象，属于晚期阶段，5年生存率较低[8]。病理学的发展和生物标志物的挖掘，能够更好地分析结直肠癌等恶性肿瘤的习性和确认病理特征[9]。常见的结肠癌相关肿瘤标志物有癌胚抗原、糖类抗原CA199和糖类抗原CA724等[10]。然而，这些标志物特异性不强，灵敏度不高，对肿瘤早期病理诊断和预后评估作用并不明显[11]。因此，挖掘新型生物标志物成为预测与改善结直肠癌患者预后的重要方向。
SPOCK1属于新发现的Ca2+结合蛋白多糖家族成员之一，此家族的共同特点是有相似的N端、C端及含有卵泡素样结构的区域，参与细胞的增殖、黏附及转移等生理与病理过程[4]。研究发现，该家族的多个成员，包括SPARC、SPARCL1等的异常表达通过调节肿瘤增殖、黏附及基质间互作在结直肠癌发生、发展过程中起到了重要作用[12-13]。SPOCK1与SPARC在结构上有极高的相似性[14]。近年来文献表明，SPOCK1还广泛参与肿瘤的发生与发展，在癌细胞间质重构中起到重要的调节作用，从而促进癌细胞生长、侵袭与转移[15]。研究发现，SPOCK1的功能受其分解的多糖片段影响，这些片段能够特异性地与生长因子、趋化因子和基质结构等结合，癌细胞则通过吸收这些片段获得生长优势，进一步增强侵袭作用[16]。本研究发现，SPOCK1在结直肠癌组织中的表达明显高于正常组织，且与淋巴结转移和TNM分期相关，表明异常高表达的SPOCK1在结直肠癌发生、发展与转移过程中发挥着关键作用。
上皮间质转化(epithelial-mes-enchymal transition，EMT)在肿瘤的侵袭和转移中发挥至关重要的作用，MMPs则与EMT的发生密切相关[17]。相关研究表明，SPOCK1可通过调控EMT促进肿瘤侵袭与转移，而沉默SPOCK1不仅会使肿瘤细胞侵袭转移能力与EMT的发生明显受抑，还能明显下调MMPs表达[5]。因此，异常高表达的SPOCK1可通过上调MMPs诱导EMT发生，进而促进结直肠癌的发生、发展与转移。本研究首先通过数据库确认与SPOCK1表达呈正相关的MMPs，其中包括MMP11、MMP9在内的13种MMPs，但仅5种在结直肠癌组织中表达明显高于正常组织。通过数据库分析，最终确定在结直肠癌中MMP11和MMP9是与SPOCK1最为密切的MMPs。免疫组织化学检测同样发现，三者在结直肠癌组织中的表达明显高于正常组织，且三者之间呈正相关。不仅如此，三者表达均与临床病理学参数相关，但各自存在差异，并且当三者均为阳性时，预示结直肠癌恶性程度更高、分期更晚。故三者联合检测对于临床病理学的诊断具有强化作用。这也为证明SPOCK1通过上调MMPs促进结直肠癌发生、发展的作用提供临床依据。
综上所述，SPOCK1、MMP11和MMP9在结直肠癌组织中表达明显高于正常组织，三者间呈正相关；
SPOCK1、MMP11和MMP9联合检测对患者临床病理特征具有指导价值，并为寻找结直肠癌潜在的靶点提供良好的理论基础。
