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邱立彬，张新才，赵 倩
潍坊市人民医院 心血管内科，山东 潍坊 261041
心肌缺血是导致心肌梗死甚至心力衰竭发生的关键因素[1-2]。分化拮抗非编码RNA(differentiation antagonizing non-protein coding RNA,DANCR)是一种癌相关长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)，其异常表达影响多种癌细胞的异常增殖及凋亡[3]，有报道lncRNA-DANCR与缺氧心肌细胞的损伤及凋亡关系密切[4]，但调控机制尚不明确。本研究通过基因预测软件发现lncRNA DANCR与miR-3646有靶向结合位点，且miR-3646已被发现在心肌缺血患者血清中高表达，并能通过靶向炎性和增殖等相关因子表达参与心脏病的进程[5]，提示lncRNA DANCR很可能通过靶向调控miR-3646发挥抗心肌细胞损伤作用。本文采用大鼠心肌H9c2细胞建立缺氧心肌细胞损伤模型，研究心肌细胞缺氧损伤的分子及基因调控机制，以期为lncRNA DANCR在心肌损伤及心衰领域的治疗提供理论依据。
1.1 材料
大鼠心肌细胞系H9c2(深圳百恩维生物公司)；
LncRNA-DANCR过表达载体(pc-DANCR)、pc-DANCR过表达阴性对照载体(pc-NC)、miR-3646模拟物(miR-3646 mimic)、miR-3646模拟物阴性对照(mimic NC)、RNA干扰Ho-1载体(shHo-1)及其阴性对照(shRNA)(均上海生工生物公司合成)；
反转录试剂盒(上海恒斐生物公司)；
活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)、血红素加氧酶1(Ho-1)等抗体(Abcam公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞的培养与分组：将新购的大鼠心肌H9c2细胞复苏后用DMEM培养基进行传代培养。取对数期细胞，调整细胞为1×106个/mL，参照文献[6]方法在缺氧培养箱(37 ℃、5% CO2、95% N2)中缺氧培养3 h，以复制缺氧模型。
将H9c2细胞分为：对照组、缺氧组、pc-DANCR(DANCR过表达)组、pc-NC(DANCR过表达对照)组、miR-3646 mimic(miR-3646模拟物)组、mimic NC(模拟物对照)组、pc-DANCR+miR-3646 mimic组，每组设置6个复孔。对照组正常培养。缺氧组(95% N2、5% CO2，3 h)。pc-DANCR组、pc-NC组、miR-3646 mimic组、mimic NC组、pc-DANCR+miR-3646 mimic组细胞，在依次转染pc-DANCR、pc-NC、miR-3646 mimic、mimic NC、pc-DANCR和miR-3646 mimic后24 h，进行缺氧处理3 h。
1.2.2 RT-qPCR检测细胞lncRNA-DANCR、Ho-1 mRNA和miR-3646表达水平：RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA，反转录得到cDNA，用RT-qPCR扩增lncRNA-DANCR、Ho-1、miR-3646目的片段。反应体系和反应条件按qRT-PCR试剂盒说明书进行。LncRNA-DANCR和Ho-1 mRNA以GAPDH为内参，miR-3646以U6为内参，用2-△△Ct法计算细胞中lncRNA-DANCR、Ho-1 mRNA和miR-3646相对表达。
1.2.3 CCK-8法检测细胞生存率：各组细胞按每孔100 μL接种于6孔板中，加入10%的CCK-8溶液继续培养2 h后，测各孔在450 nm波长下的A(absorbance)值，按公式：生存率(%)=实验组A/对照组A×100%，计算细胞生存率。
1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率：各组细胞加入annexin V染液及PI染液避光孵育10 min，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。
1.2.5 电镜观察细胞损伤：戊二醛及四氧化锇固定细胞，醋酸铀水溶液染色处理后，电镜下观察细胞结构变化。
1.2.6 Western blot检测cleaved caspase-3及Ho-1蛋白表达：各组细胞粉碎匀浆后，提取总蛋白，BCA法定量检测蛋白浓度，进行凝胶电泳、PVDF转膜、封闭后，加1∶1 600的cleaved caspase-3及Ho-1一抗抗体，1∶2 000内参β-actin抗体，4 ℃过夜孵育，1∶3 000的辣根过氧化物酶缀合的二抗室温孵育120 min，化学发光显色试剂盒显色，全能型凝胶成像分析系统分析蛋白表达。以β-actin为内参计算cleaved caspase-3及Ho-1的相对表达量。
1.2.7 双荧光素酶试验验证lncRNA DANCR、Ho-1与miR-3646的靶向关系：starbase网站预测lncRNA DANCR、Ho-1与miR-3646互补配对的碱基序列。建立含有miR-3646结合位点的DANCR或Ho-1野生型(WT)和突变型(MUT)片段，并分别克隆至荧光素酶报告质粒中，以合成DANCR-3′UTR-WT、Ho-1-3′UTR-WT及DANCR-3′UTR-MUT、Ho-1-3′UTR-MUT质粒，Lipofectamine 3000转染试剂在293T细胞中共转染模拟物对照或miR-3646模拟物，48 h后，双荧光素酶报告分析系统检测荧光素酶活性。
1.2.8 LncRNA DANCR与miR-3646下游Ho-1的调控作用验证：H9c2细胞设置为：pc-NC组、pc-DANCR组、shHo-1组、shNC组、pc-DANCR+shHo-1组，NC组及pc-DANCR组、shHo-1组及shNC组分别用Lipofectamine 3000转染试剂盒将pc-NC及pc-DANCR、shHo-1及shNC分别转染至H9c2细胞中；
pc-DANCR+shHo-1组在pc-DANCR组基础上，转染shHo-1。各组转染后进行缺氧处理3 h，检测生存率。
1.3 统计学分析
2.1 H9c2细胞miR-3646及lncRNA DANCR转染效果判定
转染pc-DANCR组细胞，lncRNA DANCR表达高于pc-对照组(P<0.05)，转染miR-3646 mimic组细胞，miR-3646表达高于模拟物对照组(P<0.05)(图1)。
*P<0.05 compared with pc-NC or mimic NC图1 miR-3646及lncRNA DANCR转染效果比较Fig 1 Comparison of transfection effects of miR-3646 and lncRNA DANCR
2.2 过表达lncRNA DANCR或miR-3646对缺氧诱导的H9c2细胞结构损伤的影响
对照组H9c2细胞结构正常。缺氧组、模拟物对照组及pc-对照组H9c2细胞可见线粒体空泡化、内质网层状结构及核糖体减少。与pc-对照组比较，pc-DANCR组细胞线粒体结构、内质网层状结构及核糖体逐渐增多。与模拟物对照组比较，miR-3646模拟物组细胞线粒体及内质网空泡化加重。pc-DANCR+miR-3646模拟物组神经元结构损伤较pc-DANCR组严重(图2)。
In the control group, mitochondria were bilayer, endoplasmic reticulum was monolayer, ribosome had no membrane, and the structure of the three organelles was normal;In anoxia group, mimic NC group and pc-NC group, mitochondrial vacuolation, lamellar structure of endoplasmic reticulum and reduction of ribosomes were observed; In pc-DANCR group and pc-DANCR + miR-3646 mimic group, mitochondrial structure, endoplasmic reticulum lamellar structure and ribosomes increased gradually; The vacuolation of mitochondria and endoplasmic reticulum was aggravated in miR-3646 mimic group
2.3 过表达lncRNA DANCR或miR-3646对缺氧诱导的H9c2细胞生存率及凋亡率的影响
与对照组相比，缺氧组细胞生存率降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)。与缺氧组相比，pc-DANCR组细胞生存率升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)。miR-3646模拟物组细胞生存率较缺氧组进一步降低，凋亡率较缺氧组进一步升高(P<0.05)。与pc-DANCR组相比，pc-DANCR+miR-3646 mimic组细胞生存率降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)(图3)。
2.4 过表达lncRNA DANCR或miR-3646对缺氧诱导的H9c2细胞cleaved caspase-3和Ho-1蛋白表达的影响
与对照组相比，缺氧组Ho-1及cleaved caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)。与缺氧组相比，pc-DANCR组H9c2细胞Ho-1蛋白表达升高(P<0.05)，cleaved caspase-3蛋白表达降低(P<0.05)。与缺氧组相比，miR-3646模拟物组Ho-1蛋白表达降低，cleaved caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)。与pc-DANCR组相比，pc-DANCR+miR-3646模拟物组Ho-1蛋白表达降低，cleaved caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)(图4)。
2.5 LncRNA DANCR、Ho-1对miR-3646靶向调控的影响
LncRNA DANCR、Ho-1与miR-3646之间有靶向结合位点。293T细胞共转染miR-3646 mimic和无突变的lncRNA DANCR-WT载体、Ho-1-WT载体，均可使293T细胞中荧光素酶活性显著下降(P<0.05)，而共转染miR-3646模拟物和发生突变的lncRNA DANCR-MUT载体、Ho-1-MUT载体对荧光素酶活性无显著作用(图5)。
2.6 LncRNA DANCR对Ho-1调控的影响
与pc-对照组相比，pc-DANCR可提高缺氧诱导的H9c2细胞Ho-1表达，并提高生存率(P<0.05)；
干扰Ho-1后，与pc-DANCR组相比，lncRNA DANCR+shHo-1组缺氧诱导的H9c2细胞生存率降低(P<0.05)(图6)。
A.flow cytometry of each group；
B.comparison of survival rate and apoptosis rate of cells in each group；
*P<0.05 compared with control; # P<0.05 compared with anoxia and pc-DANCR
本文在心肌H9c2细胞缺氧损伤模型发现，H9c2细胞线粒体空泡化、内质网颗粒脱落等结构损伤严重，细胞凋亡率及凋亡蛋白cleaved caspase-3表达升高，提示缺氧诱导心肌细胞损伤模型建模成功。
有报道lncRNA DANCR的异常表达与肝癌、肺癌等癌细胞异常增殖及凋亡关系密切[7]，lncRNA DANCR可靶向上调缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达减轻缺氧后心肌细胞损伤[8]，且lncRNA DANCR能靶向调控miR-423-5p，改善血管内皮细胞异常凋亡及迁移，在缺血缺氧性心脏疾病发展过程中扮演重要角色[9]。本研究也发现，上调lncRNA DANCR表达，可明显改善缺氧诱导的H9c2细胞凋亡。LncRNA DANCR通过哪种miRNA参与缺血性心脏病发展？本文发现lncRNA DANCR与miR-3646之间有靶向结合位点，且miR-3646已被证实是一种致癌因子，可通过靶向上调增殖活性因子(Ki-67)表达，影响细胞周期发展加重乳腺癌进程[10]。另外，miR-3646在缺血性心脏病患者血清中表达升高，并影响血管内皮及平滑肌细胞的炎性因子表达而参与冠状动脉疾病的发展[5]。本研究发现，miR-3646过表达可加重缺氧诱导的H9c2细胞凋亡，还可明显减弱lncRNA DANCR发挥的抗凋亡作用，提示lncRNA DANCR可靶向下调miR-3646表达来减轻缺氧诱导的H9c2细胞凋亡。
A.Ho-1 and cleaved caspase-3 protein expression in each group；
B.comparison of Ho-1 and cleaved caspase-3 protein expression in each group；
*P<0.05 compared with control; # P<0.05 compared with anoxia and pc-DANCR
A.prediction of binding sites of lncRNA DANCR, Ho-1 and miR-3646；
B.double luciferase verification of lncRNA DANCR, Ho-1 and miR-3646
A.Ho-1 protein expression of each group of cells；
B.comparison of Ho-1 protein expression and survival rate in each group；
*P<0.05 compared with pc-NC and shNC, respectively; # P<0.05 compared with pc-DANCR and shHo-1, respectively
Ho-1上调表达可催化活性氧(ROS)转化为无毒物质，催化血红素降解为CO和胆绿素等来发挥抗应激保护作用[11]。缺氧条件下，提高细胞内Ho-1表达，可提高细胞抵御缺氧刺激损伤的能力进而保护细胞[12]。本研究发现，miR-3646靶向负调控Ho-1，敲减Ho-1也可降低缺氧条件下H9c2细胞生存，且上调lncRNA DANCR抗损伤的同时，Ho-1表达也明显升高，另外，上调miR-3646表达，在加重缺氧诱导的H9c2细胞凋亡的同时，可检测到Ho-1表达的降低，且Ho-1敲低，也可减弱lncRNA DANCR发挥的提高缺氧诱导的H9c2细胞生存作用，证实lncRNA DANCR可靶下调miR-3646表达，促进Ho-1表达来减轻缺氧诱导的H9c2细胞凋亡。
综上所述，lncRNA DANCR可靶下调miR-3646表达，促进Ho-1表达来减轻缺氧诱导的H9c2细胞凋亡。这为抗心肌缺血及冠心病的治疗提供一定思路。但Ho-1抗凋亡作用的机制需深入研究，miR-3646过表达，并不能完全减弱lncRNA DANCR的抗凋亡作用，提示lncRNA DANCR还可能通过其他途径发挥抗心肌缺血作用。
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