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张可可 陈建新 赵慧辉 贾彩霞 李韶菁
(1 中国中医科学院中药研究所，北京，100700；
2 长沙卫生职业学院，长沙，410100；
3 北京中医药大学，北京，100029)
咽炎(Pharyngitis)是一种常见的感染性疾病，即在咽部发生了炎症反应。当寄生在咽部的溶血性链球菌作为其致病菌引起时，若得不到及时的治疗，有可能会发生风湿性心脏病、感染性心内膜炎、风湿性关节炎等一系列严重并发症。因此，对咽炎的及时治疗刻不容缓。Symmap数据库，是由实验室与中国科学院自动化研究所合作研发的综合类大型网络平台，它是第一个公开包含全面信息的可视化数据库，这些信息包括：关于中医症状之间的关系，中医证候和中草药。Symmap数据库对于药理作用的研究、中药活性成分的寻找、中药机制的研究有着至关重要的意义[1]。课题组前期研究表明小儿咽扁颗粒对大鼠25%氨水喷雾急性咽炎模型有着良好的抗炎作用，本文利用网络药理学这一方法，分析其起效机制。
1.1 网络药理学分析
1.1.1 小儿咽扁颗粒所含成分的收集与筛选 小儿咽扁颗粒主要由金银花、玄参、麦冬、桔梗、金果榄、射干、牛黄、冰片8味中药组成，具有清热利咽、解毒止痛的功效[2]。由于受目前分离、提纯工艺技术的限制，中药所含化学成分十分复杂，通过检索数据库、分析文献来搜集其有效成分。通过查阅和调研国内外文献，同时在实验室新开发的通过症状绘图增强的中医综合Symmap数据库(http://www.symmap.org/)[1]、中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)收集小儿咽扁颗粒的中药化学成分，并对收集到的化合物进行筛选。按文献报道来设置筛选条件，筛选条件为“口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18”[4]。有些数据库中缺失的化合物，则按文献报道[5]进行增补，将与炎症相关的中药有效成分加入进来。最后，将筛选后的化合物与增补后的化学成分进行汇总。
1.1.2 小儿咽扁颗粒中药-化学成分网络构建与分析 通过利用Cytoscape 3.5.1软件对小儿咽扁颗粒的中药-化学成分进行网络构建。此网络代表小儿咽扁颗粒内8味中药与其有效成分之间的关系。
1.1.3 小儿咽扁颗粒中化学成分相关靶点的获取 在Symmap数据库、TCMSP数据库中检索小儿咽扁颗粒所含8味中药成分，并通过中药成分，找到相关的靶点蛋白，并在Symmap数据库中找到其相应的基因型表型。
1.1.4 咽炎相关靶点获取 在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、在线《人类孟德尔遗传》(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)(http://www.omim.org/)[3]数据库中检索与咽炎相关的靶点蛋白。搜索的关键词为咽炎，在这2个数据库中对关键词进行搜索，以检索到相应的疾病靶点蛋白，并在Symmap数据库中找到其相应的基因型表型。
1.1.5 中药有效成分相关靶点与咽炎相关靶点的相互映射 在GeneCards数据库搜索咽炎相关蛋白，与小儿咽扁颗粒的靶点进行映射，得到小儿咽扁颗粒治疗咽炎的共同靶点。
1.1.6 映射后的靶点蛋白相互作用网络构建、核心靶点的寻找 运用Cytoscape 3.5.1软件构建，制作出“中药-化学成分-靶点”网络图。运用String 11.0、Cytoscape构建映射后的靶标之间的相互作用网络图，靶标之间的连线代表二者之间的相互作用。通过使用Cytoscpe自带软件找出核心靶点。
1.1.7 小儿咽扁颗粒治疗急性小儿咽炎预测靶标富集分析 使用映射后的基因型表型，在功能注释生物信息学微阵列分析(Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis，DAVID 6.8)数据库(https://david.ncifcrf.gov/)数据库中获得基因相关的通路富集分析，包括体内生物过程的通路分析以及基因本体(Gene Ontology,GO)通路分析。
网络药理学部分结果由Symmap数据库、TCMSP、人类基因数据库(GeneCards)、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)、uniprot数据库、DAVID 6.8数据库、Omicshare(http://www.omicshare.com/)自动计算P值(P<0.05)生成。
1.2 动物实验验证
1.2.1 动物 Sprague Dawley大鼠60只(SPF)，雌雄各半，体质量180～220 g。三级实验室屏障环境饲养，动物购于北京百诺威生物科技有限公司，许可证号SCXK(京)。实验方案实施前获得中国中医科学院中药研究所实验动物管理和使用委员会的审核和批准(伦理审批号：2018B154)。
1.2.2 药物 小儿咽扁颗粒[华润三九(黄石)药品有限公司，批号:1803007Z]、阿司匹林肠溶片(拜耳医药保健有限公司，批号：BJ38903)、高活性干酵母(安琪酵母有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司，批号：1409143203)。
1.2.3 试剂与仪器 肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)试剂盒(欣博盛生物科技有限公司，批号：R180710-102a)、白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)试剂盒(欣博盛生物科技有限公司，批号：R180710-003a)、IL-1β试剂盒(欣博盛生物科技有限公司，批号：R180710-007a)；
医用电子体温计(迈克大夫，型号:MT1961)、酶标仪(SUNRISE，瑞士，型号:16039400)。
1.2.4 分组与模型制备 将根据给药方法分为正常组、模型组、阿司匹林组、小儿咽扁颗粒低剂量组、小儿咽扁颗粒中剂量组、小儿咽扁颗粒高剂量组。每组10只。大鼠禁食不禁水8 h，每小时测体温1次，连续2次，选体温变化不超过0.3 ℃的动物备用，平均体温作为正常体温。给留用大鼠背部皮下注射20%酵母悬液10 mL/kg，6 h后测定体温，选取体温升高0.8 ℃以上大鼠作为实验动物。
1.2.5 给药方法 小儿咽扁颗粒配制方法：使用时以无菌生理盐水配制成混悬液，现用现配；
阿司匹林肠溶片配制方法：称取阿司匹林肠溶片300 mg，加入适量蒸馏水研磨成均匀的混悬液，并定容至100 mL，即得阿司匹林混悬液，现用现配；
25%干酵母悬液配制方法：称取高活性干酵母10 g置于研钵中，加入适量蒸馏水研磨成均匀的混悬液，并定容至50 mL，即得20%干酵母悬液，现用现配。各组采取灌胃给药，模型组按照10 mL/kg剂量给予生理盐水、阿司匹林组按200 mg/kg给予阿司匹林混悬液，小儿咽扁颗粒组分别给予低剂量(3 g/kg)、中剂量(6 g/kg)、高剂量(12 g/kg)小儿咽扁颗粒混悬液。正常组不给药。
1.2.6 检测指标与方法 1)测基础体温:取大鼠置于恒温的实验室环境中，每天用蘸有少量液状石蜡的体温计轻轻插入肛门内2 cm测肛门温度(体温)，连续3 d使适应环境和测温刺激。各组灌胃给药，分别于给药后0.5、1、2、4、6 h测定肛门温度。给药前体温为发热体温。2)炎症介质水平：给药后6 h后，腹主动脉采血，取血清，进行炎症介质测定。
2.1 小儿咽扁颗粒所含成分的收集与筛选 小儿咽扁颗粒中收集到了97个化学成分满足筛选条件，其中金银花23个、射干17个、金果榄10个、玄参9个、桔梗7个、牛黄15个、冰片3个、麦冬13个。其中金银花所含的化学成分数量最多，占全方总化学成分数量的23.7%；
排名第2位的是射干，所含化学成分数量占全方总化学成分数量的17.5%，排名第3位的是牛黄，所含化学成分数量占全方总化学成分数量的15.5%。
2.2 小儿咽扁颗粒中药-化学成分网络构建与分析 如图1所示，黄色的方框代表小儿咽扁颗粒里的8味中药，分别为金银花、玄参、麦冬、桔梗、金果榄、射干、牛黄、冰片；
蓝色方框代表每个中药中的化学成分(金银花23个、射干17个、金果榄10个、玄参9个、桔梗7个、牛黄15个、冰片3个、麦冬13个)，连线表示化学成分与中药的所属关系，小儿咽扁颗粒中每一味中药所包含的化学成分，共97个。表1为图1中各化学成分的具体名称。其中谷固醇(Beta-sitosterol)为金银花、麦冬、玄参所共同包含；
木樨草素(Luteolin)为金银花、桔梗、射干所共同包含；
豆甾醇(Stigmasterol)为金银花、射干所共同包含。
表1 化学成分编号对应名称
图1 小儿咽扁颗粒中所含中药及其化学成分网络关系图
2.3 中药-化学成分-靶点网络构建与分析 该网络包含311个节点和675条边，97个化合物的网络的节点自由度为4.341。见图2。
图2 小儿咽扁颗粒治疗炎症疾病的中药-化学成分-靶点网络关系
2.4 成分靶点相互作用网络构建与分析 治疗咽炎的相关蛋白，与小儿咽扁颗粒的靶点进行映射，得到107个小儿咽扁颗粒治疗咽炎的靶点，并找到作用于这些靶点的成分。见表3。对映射后的靶点构建网络图。见图3。MYST组蛋白乙酰转移酶(单核细胞白血病)4[MYST Histone Acetyltransferase(Monocytic Leukemia)4，MYST4]、三磷酸腺苷结合盒亚家族A成员1(ATP-binding Cassette Sub-family A Member 1，ABCA1)、视黄酸受体α(Retinoic Acid Receptor Alpha，RARA)、与Runt相关转录因子1(Runt-related Transcription Factor 1，RUNX1)为核心靶点。核心化合物是隐黄素(Kryptoxanthin)。见表2。
图3 小儿咽扁颗粒治疗炎症疾病的成分靶点相互作用网络与核心靶点关系图
表2 小儿咽扁颗粒治疗咽炎的核心靶点
表3 小儿咽扁颗粒治疗咽炎靶点对应成分
2.5 金银花、射干靶点分析与差异性基因分析 如图4所示，金银花和射干共同含有的治疗炎症的靶标蛋白数量为8个，占靶标蛋白的7.8%；
其中金银花独有的靶标蛋白数为91个，占总靶标蛋白的89.2%；
射干独有的靶标蛋白数为3个，占总靶标蛋白的2.9%。小儿咽扁颗粒中，金银花的靶标蛋白数目占全方治疗炎症疾病总靶点蛋白数目的41.5%。而排名第2位的牛黄和排名第3位的射干的靶标蛋白数目分别占全方治疗炎症疾病总靶点蛋白数目的41.5%。其余7味中药治疗炎症疾病的靶点蛋白数占全方治疗炎症疾病总靶点蛋白数目的18.2%和17.7%，在数量上远远低于金银花。
图4 金银花与射干共有及特有的治疗炎症的靶点分析
2.6 小儿咽扁颗粒治疗咽炎靶点的生物过程、富集分析 对小儿咽扁颗粒与炎症相关的107个目标靶点进行京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析和GO生物过程分析。其中，排位前20位的GO生物过程与KEGG通路分析如图5、图6所示。在GO分析中，对药物的反应、对乙醇的反应、凋亡过程的负调控、转录过程的正调控、基因表达的正调控、对雌二醇的反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等排位靠前。在KEGG通路分析中显示，小儿咽扁颗粒治疗咽炎的机制可能与肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)信号通路、叉头框O(Forkhead Box O,FoxO)信号通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine Protein Kinase,PI3K/AKT)信号通路、缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF-1)信号通路、T细胞受体信号通路、P53信号通路、核转录因子(Nuclear Factor Kappa B，NF-κB)信号通路、类节点受体信号通路、Toll样受体信号通路、酪氨酸激酶受体(Receptor Kinases Tyrosine)、ErbB信号通路、催乳素信号通路、巴尔病毒感染、促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK)信号通路、蛋白酪氨酸激酶、Janus激酶信号转导子及转录激活因子(Janus Kinase/Signal Transducer and Activators of Transcription，JAK-STAT)信号通路、鞘脂类信号通路等有关。
图5 GO生物过程分析
图6 KEGG通路分析HTLV-1改为1型人T细胞白血病病毒
2.7 各组时间点体温测定结果 模型组大鼠体温显著性升高；
阳性对照药的阿司匹林于给药后0.5、1、2、4、6 h均可显著降低大鼠体温；
小儿咽扁颗粒中剂量组和高剂量组于给药后1 h和2 h，大鼠体温呈下降趋势。见表4。
表4 各组不同时间点体温
2.8 各组IL-6，IL-1β和TNF-α比较 给药6 h后，模型组IL-6，IL-1β和TNF-α均显著性提高差异有统计学意义(P<0.01)；
阳性药阿司匹林组可显著性降低血清中IL-6，IL-1β和TNF-α的含量差异有统计学意义(P<0.01)；
小儿咽扁颗粒低剂量组、中剂量组和高剂量组对于血清中IL-6，IL-1β和TNF-α的含量呈现出下降的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。
传统的中药研究方法一般是通过从原药材中提取、分离其有效成分，再通过动物实验、细胞实验、分子生物学实验、临床试验进行有效性和安全性等各种指征测评，最终应用于临床诊治。这种方法的优点是以实验作为支撑，将各种情况反映出来，缺点是进程较为缓慢。近些年来，随着互联网技术的迅速发展，一系列通过计算机研究中药的方法应运而生[6-10]。网络药理学作为生物信息学其中一种研究手段，对中医药化学成分复杂的复方制剂，中药药理的多成分、多通路、多靶点的作用特点，相较于传统方法有着很大的优势。
咽炎是一种感染性疾病，可由多种致病菌引起，致病菌A组溶血性链球菌(Group A Streptococcus，GAS)可能引起诸如急性肾小球肾炎、感染性心内膜炎、风湿性心瓣膜病、风湿性关节炎等并发症。有循证研究表明，5岁以上儿童GAS痰培养阳性检出率随年龄的增加而增加[11]。因此，一旦确定感染为溶血性链球菌时，及时而有效的抗感染治疗措施十分重要。现代医学治疗咽炎的方法一般是进行药敏试验，确定感染菌株，再决定是否进行抗感染治疗。若进行抗感染，则使用青霉素类、大环内酯类抗生素[12]。中医治疗咽炎也有不良反应较少、价格低廉等优势。
本文采用网络药理学的研究方法，通过多个角度探究了小儿咽扁颗粒治疗咽炎的潜在分子机制和靶点通路。通过筛选小儿咽扁颗粒中所含的化学成分，并通过成分所寻找的靶点，与通过咽炎这一疾病所寻找的靶点相互映射，从而找到了小儿咽扁颗粒治疗咽炎的靶点，并且通过计算，确定了其中起重要作用的关键化合物隐黄素和关键靶点MYST4、ABCA1、RARA、RUNX1。隐黄素是一种天然色素，可在体内转化成为视黄醇，是一种抗氧化剂，起到保护视杆细胞的效果[13]。RARA则为隐黄素的受体[14]，涉及的疾病是急性早幼粒细胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia，APL)，其发生的机制由染色体基因的异位所引起。研究发现，ABCA1是胆固醇从周围逆向转运的关键蛋白分子，可作为治疗低密度脂蛋白胆固醇血症的关键靶点，起到防治心血管疾病的作用[15-16]，研究者在2017年发现了其三维结构[17]。RUNX1是在转录过程中的一种蛋白质，与它相关的疾病是急性髓性白血病1蛋白，相关疾病为急性髓性白血病M2型、急性淋巴性白血病、骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndrome，MDS)[18]。MYST4位于10号染色体2区2带2号，与其突变相关的疾病有子宫平滑肌瘤[19]、MDS[20]。以上结果为我们提供了更多研发中成药治疗急性咽炎乃至其他疾病，如心血管疾病、白血病等提供了新的思路和线索，对于精准医疗和转化医学的实施也有一定的意义。
方中金银花和射干共为君药，金银花可清热解毒、疏散风热，射干可清热解毒、消痰利咽；
金果榄、玄参、麦冬、桔梗4味药共为臣药，玄参可清热凉血，泻火解毒，麦冬可养阴润肺、益胃生津、清心除烦，桔梗可宣肺祛痰、利咽排脓；
牛黄、冰片为佐药，牛黄可化痰开窍、凉肝熄风、清热解毒，冰片可开窍醒神、清热止痛。其中金银花、射干、金果榄、玄参、冰片在实验中均表明有一定的抗菌作用，牛黄和麦冬有一定的抗炎作用。通过网络分析，从数量上来看，金银花、牛黄、射干治疗咽炎的靶点蛋白数目较多，起主要作用。进一步对金银花、射干靶点分析得出金银花可能为小儿咽扁颗粒治疗咽炎的主要药物。这与以中医基础理论为指导的方剂配伍组成中的组方关系中，金银花为君药的配伍关系不谋而合。现代药理发现，金银花中的有效成分黄酮类、绿原酸类、挥发油类可以抑制革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌的生长，且对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus,MRSA)也有效果；
同时，通过抑制渗出、抑制增生、解热、增强巨噬细胞的吞噬功能等过程，起到抗炎作用。
通过对小儿咽扁颗粒治疗咽炎在生物过程富集分析，在GO生物过程中，对药物的反应、对乙醇的反应、凋亡过程的负调控、转录过程的正调控、基因表达的正调控、对雌二醇的反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等过程，与治疗咽炎可能有一定的相关性。
在KEGG信号通路分析中，小儿咽扁颗粒治疗咽炎的机制可能与TNF信号通路、FoxO信号通路、PI3K/AKT信号通路、HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路、P53信号通路、NF-κB信号通路等有关。TNF信号家族包括细胞凋亡信号通路、JAK信号通路、NF-κB信号通路，主要功能是促进细胞生长、分化、诱导细胞凋亡、促进炎症的发生。根据GO分析和KEGG分析，进一步表明小儿咽扁颗粒对急性咽炎从多方面、多层次防治急性咽炎。
通过运用网络药理学的方法探索了小儿咽扁颗粒治疗急性咽炎的作用机制，分析了其治疗的潜在物质基础和有效靶点。发现小儿咽扁颗粒可以通过对药物的反应、抑制细胞凋亡等过程治疗咽炎，其作用机制可能与TNF、FoxO、PI3K/AKT、HIF-1、T细胞受体信号通路有关，其中TNF信号通路可能是其发挥作用的关键通路；
关键化合物是隐黄素，关键靶点是ABCA1、RARA、RUNX1、MYST4。但是，网络药理学研究尚有一定的局限性，如某些化合物、靶点数据库中还并未收录，数据库信息并未及时更新，中药的品种、产地、炮制均对药物的成分含量有一定影响，患者个体差异也对药效有一定影响。因此，今后仍有必要对研究进行改进和深入研究。
