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邓志鹏，张萧，田海涛
(山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355)
异绿原酸A(Isochlorogenic acid A)，又名3, 5-二咖啡酰奎宁酸(3,5- Dicaffeoylquinic acid)，由一分子奎宁酸和两分子咖啡酸缩合而成，属于咖啡酰奎宁酸类中的二咖啡酰奎宁酸类。异绿原酸A是金银花抗菌有效成分之一，所以被作为其质控指标成分[1]。二咖啡酰奎宁酸类具有抗炎[2]、抗病原微生物、抗菌[3]、降血糖、抗氧化[4-5]、脑缺血保护[6]，以及抗乙型肝炎病毒(HBV)和抗人体免疫缺陷病毒(HIV)活性等[7-8]作用。目前，临床上对于慢性乙型肝炎的治疗方法主要为化学药物抗病毒治疗，治疗药物主要有两种：一类是核苷酸类，另一类是干扰素[9]。其中核苷酸类药物在临床中应用较多，但易于产生广泛耐药性，治疗效果不理想；
而干扰素的应用较少，主要是其不良反应较为严重，比如肝损伤等[10]。研究表明，二咖啡酰奎宁酸类化合物可抑制HBV和HIV病毒复制，延缓和逆转HIV病变。因此，异绿原酸A在未来有希望研制成为治疗HBV和HIV的药物。本文对异绿原酸A大鼠体内代谢产物做了较为系统的研究，初步确证了异绿原酸A在大鼠体内的代谢产物，明确了异绿原酸A的药效物质基础。
1.1 动物
健康雄性Wistar大鼠(体重200 g±20 g)5只，购自济南朋悦实验动物繁殖有限公司(许可证号 SCXK(鲁)2019 0003)。
1.2 试药与试剂
对照品异绿原酸A(批号Y-068-190329，纯度≥98%)购自成都标纯化植有限公司；
乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。
1.3 仪器
超高压液相串接Q-Exactive Plus Orbitrap高分辨质谱(美国Thermo Fisher Scientific公司)，Sorvall Biofuge Stratos高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，EL204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，WD-12氮吹仪(杭州奥盛仪器有限公司)，大鼠代谢笼(安徽正华生物仪器设备有限公司)；
IKA Vortex天才3旋涡混匀器(广州艾卡仪器设备有限公司)，数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
2.1 药物制备
2.1.1 异绿原酸A混悬液的配制
称取异绿原酸A粉末适量，置于10 mL量瓶中，加入适量0.5%CMC-Na溶解，定容至刻度，配制成2.0 mg/mL异绿原酸A溶液。
2.1.2 对照品溶液的制备
取异绿原酸A对照品适量, 精密称定, 置100 mL容量瓶中, 加甲醇溶解, 定容至刻度制成对照品储备溶液(质量浓度为50 μg/mL)。精密量取各对照品溶液0.1 mL, 置50 mL容量瓶中, 加初始流动相定容制成对照品工作溶液(质量浓度为100 ng/mL)。
2.2 样品采集
2.2.1 血浆样品采集
Wistar雄性大鼠5只，适应性饲养1周，实验前禁食12 h，不禁水，采集空白全血，离心获得空白血浆。然后按20 mg/kg剂量灌胃给予异绿原酸A溶液，分别于给药前及给药后0.5、1、2、4、8 h于眼眶隐静脉丛取血0.5 mL，置于含有肝素钠的离心管中，静置15 min，3 000 r/min条件下离心10 min，取淡黄色血浆，于-20 ℃保存备用。
2.2.2 尿液和粪便样品采集
雄性Wistar大鼠5只，适应性饲养1周，置于代谢笼中，禁食12 h，不禁水，收集空白尿液和空白粪便。灌胃给予异绿原酸A，收集给药后0～12、12～24、24～48 h大鼠尿液及0～48 h粪便。合并尿液，3 000 r/ min离心10 min，取上清液于-20 ℃保存备用。合并粪便，在低于50 ℃条件下烘干后碾碎，-20 ℃保存备用。
2.3 样品处理
将冷冻贮存的血浆、尿液或粪便(匀浆上清液)样品室温条件下自然解冻，精密吸取血浆300 μL，涡旋 30 s，加入甲醇1.0 mL沉淀蛋白, 涡旋3 min，12 000 r/min离心10 min，上清液40 ℃条件下氮气流吹干，以初始流动相150 μL复溶, 涡旋10 s，12 000 r/ min离心10 min，取5 μL上清液注入UHPLC-MS系统进行分析。
2.4 样品检测条件
2.4.1 色谱条件
Thermo C18色谱柱(2.1 mm×100 mm, 1.9 μm)；
流动相为0.1%甲酸(A)-乙腈(B)；
梯度洗脱，0～2 min，3% B；
2～24 min，3%～25% B；
24～25 min，25%～95% B；
25～27 min，95% B；
27.0～27.1 min，95%～3% B；
27.1～30.0 min，3% B。进样室温度为10 ℃；
柱温为40 ℃；
流速为0.4 mL/min；
进样量为5 μL。
2.4.2 质谱条件
离子源为电喷雾离子源；
离子源温度为320 ℃；
电离源电压为3.3 kV；
负离子检测模式；
扫描质量范围m/z50～1 000；
鞘气以及辅助气均为氮气(纯度>99.99%)，流速分别为10.5和3.0 L/min。
2.5 数据处理
超高压液相串接Q-Exactive Plus Orbitrap高分辨质谱采集数据，Thermo Scientific Xcalibur工作站，通过比较样品与空白对照的色谱图和质谱图对数据进行分析。
3.1 异绿原酸A裂解规律分析
负离子模式下，异绿原酸A准分子离子峰理论值为[M-H]-m/z515.119 5(C25H24O12)，水解脱去一个分子咖啡酰基形成m/z353.0847 8(C16H18O9)的碎片离子，该碎片离子继续脱去一个分子咖啡酰基形成m/z191.056 1(C7H12O6)和m/z179.035 0(C9H8O4)，碎片离子m/z191.0561继续失去一个分子H2O形成m/z173.045 4；
碎片离子m/z179.035 0继续失去一个分子CO2或一个分子H2O形成m/z135.045 2、m/z161.022 4。其裂解规律如图1所示。
图1 异绿原酸A推测的裂解途径Fig.1 The proposed fragmentation pathway of isochlorogenic acid A
3.2 异绿原酸A大鼠体内代谢产物分析
根据分析得到化合物的质荷比、保留时间、特征碎片离子以及相关文献报道[11-12]，从大鼠血浆、尿液、粪便中共鉴定出包括异绿原酸A原形成分在内的10个代谢产物，其中粪便4个(M0、M1、M2、M3)，尿液6个(M4、M5、M6、M7、M8、M9)，而血浆中未检测到代谢产物。代谢产物的具体信息见OSID科学数据与内容。
3.2.1 大鼠粪便中代谢产物鉴定及分析
M0：保留时间tR为20.15 min，[M-H]-为m/z515.118 4，产生m/z353.089 0、m/z191.056 0、m/z179.034 5、m/z135.043 8的碎片离子，其中m/z353.089 0为异绿原酸A脱去一个分子咖啡酰基所形成，m/z191.056 0为异绿原酸A脱去两个分子咖啡酰基形成的奎宁酸负离子，m/z179.034 5为咖啡酸骨架负离子，m/z135.043 8为m/z179.034 5失去一个分子CO2所形成。此外，M0的保留时间和二级质谱信息与对照品异绿原酸A一致，因此，推测M0为异绿原酸A原形。
M1：保留时间tR为5.22 min，[M-H]-为m/z355.104 1(C16H20O9)，较m/z353.087 8多2 Da，推测为m/z353.087 8氢化代谢产物(C16H18O9+2H)，产生m/z181.050 2、m/z137.059 8的碎片离子，m/z181.050 2较m/z179.035 0(咖啡酸骨架负离子)多两个H，为咖啡酸负离子氢化产物，m/z137.059 8为m/z181.050 2脱去一个分子CO2形成。
M2：保留时间tR为8.28 min，[M-H]-为m/z355.103 2(C16H20O9)，较m/z353.087 8多2 Da，推测为m/z353.087 8氢化代谢产物(C16H18O9+2H)，产生m/z181.049 9、m/z173.045 0、m/z137.059 5的碎片离子，m/z181.049 9为咖啡酸负离子氢化产物(C9H8O4+2H)，m/z173.045 0为m/z181.049 9失去一个分子H2O生成，m/z137.059 5为m/z181.049 9脱去一个分子CO2形成。
M3：保留时间tR为9.04 min，[M-H]-为m/z355.103 9(C16H20O9)，较m/z353.087 8多2 Da，推测为m/z353.087 8氢化代谢产物(C16H18O9+2H)，产生m/z311.103 4、m/z191.055 8、m/z173.045 1的碎片离子，m/z311.103 9为m/z355.103 9失去一个分子CO2形成，m/z191.055 8为m/z355.103 9水解失去一个分子咖啡酰基形成，m/z173.045 1为m/z191.055 8失去一个分子H2O形成(图2)。
注：A，C为空白样品；
B, D为给药后样品。图2 大鼠粪便异绿原酸A代谢产物提取离子流图Fig.2 The representative TIC chromatograms of rat feces samples after oral administration of isochlorogenic acid A
3.2.2 大鼠尿液中代谢产物鉴定及分析
M4：保留时间tR为13.84 min，[M-H]-为m/z355.101 8(C16H20O9)，较m/z353.087 8多2 Da，推测为m/z353.087 8氢化代谢产物(C16H18O9+2H)，二级产生m/z311.112 0、m/z179.070 7的碎片离子，其中m/z311.112 0为m/z355.101 8失去一个分子CO2生成，m/z179.070 7为咖啡酸负离子(C9H8O4)。
M5：保留时间tR为14.46 min，[M-H]-为m/z355.104 2(C16H20O9)，较m/z353.087 8多2 Da，推测为m/z353.087 8氢化代谢产物(C16H18O9+2H)，推测为m/z353.087 8氢化代谢产物(C16H18O9+2H)，二级产生m/z193.034 9 、m/z179.070 8的碎片离子，m/z191.0561为奎宁酸负离子(C7H12O6)，m/z179.070 8为咖啡酸负离子(C9H8O4)，m/z193.034 9为奎宁酸负离子还原加二氢(C7H12O6+2H)。
M6：保留时间tR为17.81 min，[M-H]-为m/z369.119 1(C17H22O9)，较m/z353.087 8多16 Da，推测为m/z353.087 8氢化和甲基化代谢产物(C16H18O9+2H+CH2),二级产生m/z193.086 6、m/z175.024 1、m/z113.023 5的碎片离子，m/z193.086 6为奎宁酸负离子还原加二氢(C7H12O6+2H)；
m/z175.0241为m/z193.086 6失去一个分子H2O形成。
M7：保留时间tR为10.17 min，[M-H]-为m/z365.088 9(C17H18O9)，较m/z353.087 8多12 Da，推测为m/z353.087 8脱氢和甲基化代谢产物(C16H18O9-2H+CH2)，二级产生m/z189.055 5、m/z139.992 8、m/z113.023 8的碎片离子，m/z189.055 5为奎宁酸负离子脱氢产物(C7H12O6-2H)。
M8：保留时间tR为6.89 min，[M-H]-为m/z271.012 2(C7H12O9S)，较m/z191.056 1多80 Da，推测为m/z191.056 1硫酸化代谢产物(C7H12O6+SO3)，二级产生m/z253.108 6、m/z227.021 5、m/z191.055 3、m/z147.063 9的碎片离子，其中m/z253.108 6为m/z271.012 2失去一个分子H2O形成，m/z227.021 5为m/z271.012 2失去一个分子CO2形成，m/z191.055 3为奎宁酸负离子(C7H12O6)。
M9：保留时间tR为18.06 min，[M-H]-为m/z691.152 3(C31H32O18)，较异绿原酸A(515.119 5)多176 Da，推测为异绿原酸A的葡萄糖醛酸化代谢产物(C25H24O12+Gluc)，二级产生m/z515.119 0、m/z353.088 8、m/z191.055 7、m/z135.044 3的碎片离子，其中m/z515.119 0为m/z691.152 3失去一个分子葡萄糖醛酸而成，m/z353.088 8(C16H18O9)为m/z515.119 0水解失去一个分子咖啡酰基(C9H6O3)所形成，m/z191.055 7为奎宁酸负离子(C7H12O6)，m/z135.044 3为m/z179.035 0(咖啡酸负离子)失去一个分子CO2所形成，与原形碎片离子相同(见图3)。
注：A、C、E、G、I为空白样品，B、D、F、H、J为给药后样品。图3 大鼠尿液异绿原酸A代谢产物提取离子流图Fig.3 The representative TIC chromatograms of rat urine samples after the oral administration of isochlorogenic acid A
3.3 大鼠体内异绿原酸A代谢途径分析
异绿原酸A在大鼠体内的代谢途径主要有水解、氢化、脱氢、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化等(图4)。异绿原酸A(C25H24O12，m/z515.119 5)进入大鼠体内后，首先水解脱去一分子咖啡酰基形成单咖啡酰基奎宁酸(m/z353.087 8，C16H18O9)，单咖啡酰奎宁酸继续水解脱去一分子咖啡酰基形成奎宁酸(C7H12O6，m/z191.056 1)和咖啡酸(C9H8O4，m/z179.035 0)，单咖啡酰奎宁酸结合两个H还原得到氢化代谢产物(m/z355.103 5)，氢化加甲基化形成m/z369.119 1(m/z353.087 8+2H+CH2)，脱氢加甲基化形成m/z365.087 8(m/z353.087 8-2H+CH2)，发生硫酸化反应得到硫酸化代谢产物(m/z271.012 9)。
图4 大鼠体内异绿原酸A代谢途径推测Fig.4 Proposed metabolic pathway of isochlorogenic acid A in rats
在创新型药物研发过程中，药物代谢研究所起的作用越来越大，在进行药物代谢研究时，首先要保证分析方法的可靠性，对代谢物进行结构鉴定在许多阶段中都显得尤为重要[11-12]。高分辨率质谱具有适用范围广、分离度好、灵敏度高的优势，能够提供有关中药化学成分结构的信息，且可以与色谱技术联用在线鉴定色谱峰，为中药体内外成分表征提供强有力的支撑，在体内外药物代谢物结构鉴定中的应用也越来越广泛[13-15]。
本文采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术对异绿原酸A在大鼠粪便、尿液、血浆中的代谢产物进行了鉴定，最终根据分析得到的化合物相对保留时间、质荷比、特征碎片离子。实验中通过灌胃给药20 mg/kg异绿原酸A，在大鼠体内共鉴定出包括原形成分在内的10个代谢产物，其中粪便4个，尿液6个，而血浆中未检测到代谢产物，其代谢途径主要为水解、氢化、脱氢、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化等。本研究发现大鼠灌胃给予异绿原酸A后血浆中未检测到原形及其代谢产物，且粪便和尿液中的代谢产物也比较少，与文献[16]报道较一致。Gong等[17]大鼠灌胃给予高剂量的异绿原酸A 200 mg/kg血浆中监测到33个代谢物，我们推测代谢物的生成与给药剂量的增加有密切关系。
本实验鉴定了异绿原酸A在大鼠尿液和粪便中的代谢产物，对异绿原酸A在大鼠体内的代谢途径进行了初步推测。通过该研究对异绿原酸A在大鼠体内的代谢情况有了进一步了解，确证了异绿原酸A在大鼠体内的代谢产物，从而明确了异绿原酸A的药效物质基础，为研发新型抗HBV和抗HIV的药物提供了一定的实验依据。下一步我们将开展异绿原酸A大鼠尿液、粪便的排泄量测定评价两种排泄途径的差异。
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