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◎ 潘 宁，贺俊伟，孙萌辉，陈彬云，苏东民
（郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450002）
花生粕的营养价值极高，含有氨基酸、蛋白质、糖类等化合物[1]。研究发现，花生粕具有促进微生物发育和代谢功能，能够促进双歧杆菌的发酵[2]，还能促进乳酸菌及其他菌类的增殖，并对面包酵母充气有着促进作用。此外，有学者用脱脂花生粕为原料，将其酶解成低分子多肽后与其他辅料经加工制成天然饮品[3]。我国的花生粕主要产于花生榨油工业中，但由于高温压榨等工艺使花生粕蛋白高度变性[4]，其功能特性下降，影响了花生粕蛋白在食品工业中的推广应用，目前国内外都在寻找食品工业中有效处理花生粕的方法。
等离子体一般用于材料的表面处理，可以改变材料表面的结构及其性能[5]。在食品领域中，等离子体常被用来对食品进行灭菌、灭酶处理，延长食品的保质期。刘政等[6]用等离子体对鸡肉进行处理，杀菌率达到96.34%，表明等离子体技术具有显著的杀菌效果。等离子体还可以用于食品体系中的大分子淀粉和蛋白质的改性和优化[7]。
对花生粕进行酶解是一种分离出花生粕中有效物质的重要方法。目前，研究方法主要是利用单酶解制备花生粕多肽，但由于花生粕蛋白质组成和结构比较复杂，在花生粕蛋白酶解时，会出现酶解反应速度慢、水解度较低、水解产物功能性质差等问题，且在单酶酶解过程中所生成的蛋白存在大量疏水性氨基酸残基，影响蛋白的品质，这些问题都限制了花生粕酶解产物的利用价值[8-10]。因此，寻找一种高效的处理办法是现阶段的研究重点。课题组前期研究发现，Alcalase 碱性蛋白酶对花生粕蛋白具有较好的酶解效果，为系统揭示等离子体对花生粕蛋白酶解特性的影响，本文以花生粕为原料，进行等离子体预处理，根据处理时间的不同，对其水解度、分子量分布、氨基酸组成等指标进行测定，系统揭示等离子体对花生粕蛋白酶解特性的影响。
1.1 材料与试剂
花生粕蛋白（粗蛋白85.4%）；
Alcalase 蛋白酶（酶活为3.9×105U·mL-1，经福林法测得），Sigma公司；
Na2CO3、NaOH、酒石酸钾钠、CuSO4、硼酸钠、NaHCO3、NaH2PO4和Na2HPO4，天津市大茂化学试剂厂；
其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
CTP-2000K 等离子体实验装置，南京苏曼电子有限公司；
JSM-76490LV 扫描电子显微镜，日本JEOL公司；
TGL-16 台式高速冷冻离心机，湖南省长沙市望城经济开发区湘仪工业园；
L8900 氨基酸分析仪，日立（中国）有限公司；
Waters 1525 高效液相色谱仪，美国Waters 公司。
1.3 实验方法
1.3.1 花生粕蛋白的等离子体预处理
将2 g 花生粕蛋白溶解于50 ℃去离子水，配制成质量分数为10%的花生粕蛋白悬浮液，恒温搅拌5 min，经功率为750 W、射频25 kHz、气体压力0.18 MPa 的压缩空气、射流出口流速为30 L·min-1的等离子体处理机处理（分别处理0 s、30 s、60 s、90 s、120 s 和150 s），同时用1 mol·L-1NaOH 溶液调节其pH 值至9.0；
加入6 080 U·g-1的Alcalase 蛋白酶，恒温匀速搅拌，同时添加NaOH 溶液维持酶解体系的pH 值不变；
在酶解时间为90 min 时，将酶解液转至100 ℃水浴中加热10 min 灭酶，冷却后于4 ℃、8 000 r·min-1条件下离心10 min 除去沉淀，取上清液，将酶解残渣收集，放入离心机，于温度4 ℃、转速10 000 r·min-1条件下离心20 min，取残渣，将上清液与酶解残渣冷冻干燥，研磨即得花生粕蛋白。采用pH-stat 法计算花生粕蛋白的水解度，计算公式为
式中：V为水解过程中氢氧化钠的消耗量，mL；
Nb为氢氧化钠的浓度，mol·L-1；
α为亚麻籽粕蛋白的平均解离度，在50 ℃、pH 8.5 条件下α为0.955（无量纲）；
Mp为底物中蛋白质的总量，g；
htot为底物中每g蛋白质的肽键总数，亚麻籽粕蛋白的htot为8.38，mEq。
1.3.2 氨基酸组成分析
参考CHEN 的方法[11]，对组成花生粕蛋白的氨基酸进行分类，并计算各类氨基酸所占比例。
1.3.3 分子量分布的测定
参考张艳艳[19]的方法，采用高效凝胶过滤色谱法测定花生粕蛋白的相对分子质量分布。色谱条件：色谱柱为TSKgel 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；
流动相为乙腈-水-三氟酸（45 ∶55 ∶0.1）；
流速为0.5 mL·min-1；
柱温为30 ℃；
进样体积为20 μL；
检测波长为220 nm。
1.3.4 对酶解反应动力学研究
分别称取5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1和25 g·L-1花生粕蛋白溶液放置在恒温加热磁力搅拌器上50 ℃加热5 min，后经功率为750 W 的等离子体表面处理机处理120 s，将处理好的样品置于50 ℃，410 r·min-1的恒温加热磁力搅拌器上，用1 mol·L-1NaOH 溶液调节pH 值为9.0，并保持在9.0 不变，加入200 μL 碱性蛋白酶，前15 min 每隔1 min 记一次NaOH 消耗量，15 min 后每隔5 min 记录一次NaOH 消耗量。酶解70 min 后将酶解液水浴加热至100 ℃，灭酶10 min。以不经等离子体预处理的为对照组。测定前15 min 对酶解反应初速度的影响及其对酶解动力学参数的影响。
根据SONG 等[12]报道的实验方法研究花生粕蛋白的水解动力学得到公式为
式中：V为反应初速度，g·L-1·min-1；
KA为表观分解率常数的平均值或酶与底物结合频率的平均值，min-1；
ET为反应体系中酶浓度，g·L-1；
KM为表观常数（类似于米氏常数），g·L-1；
S为初始底物浓度，g·L-1。
1.3.5 场发射电镜测定
将样品使用真空冷冻干燥机进行干燥，敲击干燥后的样品使样品自然断裂，选择大小合适、表面平整均匀的样品，将样品固定在导电胶上，喷金，然后在15 kV 下，使用扫描电子显微镜在1 000 倍的放大倍数下观察样品的微观结构。
1.3.6 数据分析及处理
用Microsoft Excel 2016对实验数据进行整理分析，用Origin 2018 对数据进行作图。通过SPSS 18.0 进行单因素方差分析（p＜0.05）。每个实验均重复3 次，取平均值，数据结果以“平均值±标准差”的形式表示。
2.1 等离子体预处理对花生粕蛋白水解度的影响
由图1 可知，花生粕蛋白水解度随着预处理时间的增加而增加，在前20 min 内花生粕蛋白水解度（Degree of Hydrolysis，DH）呈指数增长，20 min 后增长逐渐平缓，到最后阶段趋于稳定。根据预实验，花生粕蛋白在90 min 时水解度最大，因此对花生粕蛋白酶解90 min 并记录水解度，结果如表1 所示。根据表1 结果可看出花生粕蛋白在处理120 s 时DH达到最大，为30.22%，超过120 s 之后，花生粕蛋白的DH相对降低。造成这种现象的原因是适当的等离子体预处理可以使花生粕蛋白颗粒细化、螺旋结构舒展、酶解位点暴露，更有利于酶解反应的发生；
此外，等离子体处理会引起多肽分子疏水键外露，肽链末端疏水性氨基酸增多，但当处理时间过长时，花生粕蛋白由于疏水性增加过大又会发生聚集折叠，导致溶解度下降[13]，不利于酶解反应的进行，导致DH逐渐趋于平缓。
表1 不同处理时间的花生粕蛋白水解度的参数表
图1 等离子体预处理对花生粕蛋白水解度的影响图
综上，与对照（等离子体预处理0 s）相比，等离子体预处理提高了花生粕蛋白的DH，这是由于等离子体预处理改变了花生粕蛋白的酶解特性，使得更多的与DH有关的疏水性基团暴露出来[14]。最佳的等离子体预处理时间为120 s。
2.2 等离子体预处理对花生粕蛋白酶解产物氨基酸组成的影响
氨基酸组成对蛋白酶解物酶解特性的研究具有十分重要的意义，本次试验测定了不同等离子体处理下的花生粕蛋白的氨基酸组成。如表2 所示，花生粕蛋白中酸性氨基酸含量（25.38%～27.00%）比碱性氨基酸含量（12.22%～13.88%）高，表明花生粕蛋白呈弱酸性，这与丁香丽[15]从大麦籽粒中提取的抗冻蛋白的酸性氨基酸和碱性氨基酸比例相似。花生粕蛋白中亲水性氨基酸所占比例（26.49%～28.41%）显著高于疏水性氨基酸残基所占比例（21.03%～22.23%），具有多数蛋白类物质所具有的高亲水性氨基酸含量特征[16]。
表2 等离子体预处理对花生粕蛋白氨基酸组成的影响表
从表中数据可以看出，不同等离子体处理下的花生粕蛋白均富含Glu、Arg、Asp、Leu 和Phe 5 种氨基酸，结合花生粕蛋白的DH结果，说明以上氨基酸很可能在花生粕蛋白的水解过程中起到了重要作用。其中Glu 残基（强极性羟基）、Arg 和Asp 残基（提供部分非极性环境以稳定氢键）含量较多，有助于花生粕蛋白的酶解。
2.3 等离子体预处理对花生粕蛋白分子量分布的影响
表3 为不同等离子体处理条件下花生粕蛋白中各分子量范围内肽段的相对含量。经过等离子体预处理的花生粕蛋白，分子量大于3 000 u 的分子没有明显变化，在200 ～3 000 u 的肽段显著降低，小于200 u 的小分子活性肽有显著增加，表明经过等离子体处理后花生粕蛋白分子量分布向小分子肽段转移；
在本研究中，经过不同等离子体预处理下的花生粕蛋白均富含＜1 000 u 的短肽（主要由2 ～10 个氨基酸组成），占比超56%，当等离子体预处理为120 s 时，小于1 000 u 的小分子活性肽最多，达到总含量的61.80%；
其中在预处理时间为30 s 和60 s 过程中花生粕蛋白小于1 000 u的肽段也分别达到了59.31%、58.47%。WANG 等[17-18]的研究结果与这相似，抗冻多肽的分子量主要分布在200 ～1 000 u（占比80%），分子量在500 ～2 000 u的肽段比其他分子量范围内的肽段更有效地抑制了冰晶的生长和重结晶，从而增大了酶解特性；
在本研究中，相对于对照，经过等离子体预处理的花生粕蛋白分子量在200 ～1 000 u 的肽段相对含量较高，这可能与花生粕蛋白的酶解特性较高有着一定的联系。
表3 不同等离子体预处理对花生粕蛋白分子量分布的影响表
2.4 等离子体预处理对花生粕蛋白酶解反应动力学的影响
2.4.1 等离子体预处理对花生粕蛋白酶解过程的影响在固定等离子体预处理处理时间为120 s、料液初始温度为50 ℃、功率为750 W、射频为25 kHz、气体压力为0.18 MPa 的压缩空气、射流出口流速为30 L·min-1的等离子体表面处理机的基础上，研究不同底物浓度对花生粕蛋白的多肽浓度的影响，其结果见图2。
图2 不同底物浓度的酶解进程曲线对比图
由图2 可知，等离子体预处理对花生粕蛋白的酶解过程产生了一定影响。相同的酶解时间下，底物浓度越大，被水解的蛋白浓度也越大，表明花生粕蛋白的多肽浓度随底物浓度的增加而升高。与对照样品相比，在相同的底物浓度下，酶解反应前40 min 等离子体预处理样品的多肽浓度存在小幅度提高；
酶解反应40 min 后，经过等离子处理的底物浓度为10 g·L-1、15 g·L-1的花生粕蛋白的多肽浓度相对于对照有一定程度的降低，当料液浓度为5 g·L-1、20 g·L-1、25 g·L-1时，经过等离子体处理的花生粕蛋白多肽浓度没有明显变化，造成这种现象的原因可能是料液浓度过低时，等离子体处理的作用力致使蛋白颗粒减少，而未充分相互碰撞，过高的料液浓度会影响物料的传质传热效果，而适度的料液浓度使蛋白颗粒能够充分接受等离子体处理的作用力，同时使蛋白之间发生强烈的碰撞[19]，提高了等离子体对蛋白的作用力效果。
2.4.2 等离子体预处理对花生粕蛋白酶解初速度的影响
在保持等离子体参数恒定（预处理处理时间为120 s、料液初始温度为50 ℃、功率为750 W、射频为25 kHz、气体压力为0.18 MPa 的压缩空气、射流出口流速为30 L·min-1）的情况下，研究了不同底物浓度对花生粕蛋白酶解反应初速度的影响。
从表4 可看出，其线性回归方程的相关系数均在0.85 以上，具有较好的可信度。在相同的酶解时间下，随着底物浓度的增加，初速度也随之增加；
与对照相比，实验组的初速度在相同的酶解时间下均比对照组要高，其中底物浓度为25 g·L-1的花生粕蛋白的酶解初速度最大为0.009 8，表明当底物浓度越高，溶液中越多的蛋白与酶发生碰撞反应；
底物浓度为20 g·L-1的花生粕蛋白的酶解初速度与对照相比差值最大。出现这种现象的原因是施加适当时间的等离子体预处理，可以为整个体系提供充足的能量，在一定程度上可以引起蛋白酶解特性的改变[20]。同时，当底物浓度过低时，蛋白分子与酶的碰撞不完全，不利于蛋白分子活性基团的暴露，也不利于蛋白底物和蛋白酶的相互作用[19]。
表4 酶解过程经等离子体预处理对不同底物浓度花生粕蛋白水解反应初速度的影响表
2.4.3 经等离子体预处理对花生粕蛋白酶解动力学参数的影响
表5 为花生粕蛋白经等离子体预处理后酶解反应动力学参数的变化情况。实验组与对照组相比，反应动力学参数KA基本不变，说明酶被底物饱和时的最大反应速率相近[21]。KM与米氏常数类似，表示酶对底物的匹配程度，KM越小，表明蛋白酶与底物的亲和力越强，实验组的KM比对照组降低了14.67%，表明经过等离子体预处理后可使酶与底物的亲和力在短时间内增大[22]。通过KM与KA可以表明，等离子体预处理对酶促反应动力学的影响可以通过改变酶与底物的亲和力的方式实现。
表5 酶解过程经等离子体预处理对花生粕蛋白水解动力学参数影响表
2.5 等离子体预处理对花生粕蛋白微观结构的影响
利用场发射电镜观察经等离子体预处理后花生粕蛋白的显微结构变化，其结果如图3。通过图3-A 可以看出，对照组的表面为不规则球体状，表面凹凸不平。与对照相比，实验组中图3 中B 图和C 图表面为片状结构，表面不规则有凸起，表明花生粕蛋白致密的胶团结构受到破坏，分裂成较小的网状结构[23]。实验组中图3 中E 图和F 图的表面为网状结构，表明在等离子体处理前期，蛋白质颗粒迅速细化，但在经过等离子体处理一定时间之后开始出现蛋白质分子聚集现象。等离子体处理前期由于微射流作用而引起蛋白颗粒疏松破碎，传质效果改善[19,24]；
随着等离子体处理时间的延长，花生粕蛋白以分子形态暴露出来，等离子体作用会引起蛋白质分子的疏水键外露。
图3 等离子体预处理的花生粕蛋白酶解残渣的微观结构图
花生粕蛋白表面微观形貌的变化将直接影响其酶解特性的改变。主要是表面微观形貌的变化会引起蛋白表面疏水性基团重新分布，进而影响花生粕蛋白的酶解特性；
此外，表面微观形貌的变化会引起蛋白比表面积的改变，影响蛋白与酶接触的机会进而使得蛋白酶解的速度改变[25]。
本文研究了不同等离子体预处理时间对花生粕蛋白酶解特性的影响规律。研究结果表明了等离子体预处理花生粕蛋白不仅有效提高了其水解度，而且也使得分子量分布向小分子肽段转移，使分子量主要集中在200 ～1 000 u；
通过对花生粕蛋白进行酶解动力学测定，结果表明适当时间的等离子体预处理，可以为整个体系提供充足的能量，在一定程度上可以引起蛋白酶解特性的改变。同时，等离子体预处理对酶促反应动力学的影响可以通过改变酶与底物的亲和力的方式实现。本文系统揭示了等离子体调控过程中底物蛋白关键结构域变化与其酶解特性之间的内在关联机制，为制备高效酶解和结构紧凑的花生粕蛋白提供了理论基础。
