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曹云雷，高 飞,2，李国新,2，姜一峰,2，郑 浩,2，童 武,2，黄 剑,2，童光志,2
（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；
2.扬州大学 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009）
非洲猪瘟（african swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引发的一种急性、热性的猪流行症[1]。特征是高烧（达40℃～42℃），出血，病程短以及高死亡率[2]。病毒的某些特性与虹彩病毒科及痘病毒科相似[3]。世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties,OIE）已将ASF列为法定报告动物疫病，中国也将ASF归类为一类动物疫病[4]。2018年8月，中国首例ASF在沈阳被确诊，随后迅速传播[5]。疫情目前已蔓延至我国30多个省份和地区，防控形势异常严峻。
ASFV是非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）非洲猪瘟病毒属（Asfivirus）的唯一成员，也是唯一的虫媒DNA病毒[6]。ASFV电子显微镜检测结果显示，ASFV的形态为正二十面体，直径约260 nm[7]。病毒粒子结构较为复杂，由内到外分五层组成：含病毒基因组的类核（nucleoid）、内核心壳（coreshell）、内膜（innerenvelope）、衣壳（capsid）和外囊膜（outerenvelope）[8]。
ASFV的基因组能够编码多种蛋白质，包括细胞中病毒复制，生存和宿主中转移所必需的各种蛋白质和酶[9]。p72蛋白是由B646L基因编码，是ASFV的主要衣壳蛋白。作为后期蛋白质，p72蛋白质具有构象中和表位，它能诱导机体产生中和抗体[10]，但其产生的抗体不足以有效地保护动物不受ASFV攻击。尽管如此，p72蛋白质仍然可以作为免疫抗原使用，其抗原性强健稳定[11]。
本试验根据ASFV-SY18（GenBank登录号：MH713612.1）的B646L基因序列，构建重组原核表达载体pCold-Ⅰ-p72，获得其编码的p72蛋白，通过免疫小鼠来制备多克隆抗体。
1.1 实验材料与动物参考NCBI中ASFV的ASFV-SY18（GenBank登录号：MH713612.1）毒株的B646L基因序列，并连入PUC57-simple载体中，由上海派森诺生物科技股份有限公司合成，两端插入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，经测序比对与B646L基因序列完全一致，命名为pUC57-ASFV-p72。EcoRⅠ和XhoⅠ限制性核酸内切酶购自NEB公司；
胶回收试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；
凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；
PCR相关试剂、IPTG购自TaKaRa公司；
脱脂乳（Skim Milk）购自美国BD公司；
超敏发光液A液、B液购自普利莱（北京）生物技术公司；
His标签镍株和蛋白纯化柱购自QIAGEN公司；
弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor®488）、HRP标记的羊抗鼠IgG购自Sigma公司；
考马斯亮蓝（R-250）购自Biosharp公司；
蛋白酶抑制剂（PMSF）购自碧云天生物技术有限公司。BALB/C雌性小鼠，4周龄，购自上海杰思捷实验动物有限公司。
1.2 重组原核表达载体pCold-Ⅰ-p72的构建根据ASFVB646L基因序列和pCold-Ⅰ载体序列，利用双酶切同源重组设计引物，ASFV-p72-F：5"-atgg agctcggtaccctcgagTTAGGTACTGTAACGCAGCA CAGC-3"，ASFV-p72-R：5"-caggtcgacaagcttgaattcA TGGCATCAGGAGGAGCTTTT-33"，以合成的pUC57-ASFV-p72质粒为模板，PCR扩增ASFVB646L基因片段。分别将胶回收产物与pCold-Ⅰ原核表达载体用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，酶切条件：37℃恒温水浴孵育4 h；
65℃酶热失活20 min。胶回收酶切产物用同源重组酶37℃连接40 min，将连接产物转化至BL21感受态细胞后，于37℃条件下倒置培养12 h左右，根据转化结果筛选阳性克隆。通过PCR验证结果正确后，取部分样品送上海派森诺生物科技股份有限公司测序。将测序正确的重组原核质粒命名为pCold-Ⅰ-p72。
1.3 重组原核表达载体pCold-Ⅰ-p72的诱导表达将pCold-Ⅰ-p72和pCold-Ⅰ空载体转化到BL21感受态细胞后用玻璃棒均匀地涂布在含氨苄抗性的固体LB培养基平板上，于37℃细菌培养箱中倒置培养12 h左右，随机挑取单个菌落进行扩大培养，37℃条件下200 rpm过夜摇菌。取3只含5 mL左右氨苄抗性的LB培养基，再向其中分别加入上述过夜培养的菌液，放置于37℃恒温摇床中培养至OD值达到0.6～0.8后加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，4 h后收样，对照组不加IPTG，保持与诱导组同样的培养条件。取适量诱导组和对照组的菌液，离心收集并处理菌体。通过SDS-PAGE电泳分析质粒pCold-Ⅰ-p72的诱导表达情况及重组蛋白rp72。
1.4 重组rp72蛋白的纯化通过切胶纯化法纯化重组蛋白rp72。按照1.5方法获得诱导组样品，随后进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳后，用4℃预冷的0.25 mol/L KCl溶液浸泡蛋白胶至出现银白条带，时间约为3 min，切下条带，用PBS清洗至银白色条带变得透明。研磨目的条带胶条，收集1.5 mL离心管中收集，加入适量PBS，使胶体颗粒完全溶解后放进-80℃冰箱冻溶3次，解冻后均需充分振荡。高速离心后，吸取上清液至新的1.5 mL离心管中，取少量样品进行SDS-PAGE电泳分析。
1.5 免疫小鼠准备一组4周龄的BALB/c雌性小鼠6只。用纯化的rp72蛋白免疫小鼠。免疫之前，测定纯化蛋白的浓度。1免：取纯化蛋白与等体积弗氏完全佐剂乳化后，每只小鼠100 μg蛋白量，腹部皮下注射；
2免：1免2周后每只小鼠取100 μg纯化蛋白与等体积弗氏不完全佐剂乳化，腹部皮下注射。3免：1免4周后。3免后第3 d通过眼球采血收集血清验证多克隆抗体的效果，检测效果达标后通过小鼠尾静脉注射纯化的rP72蛋白加强免疫。
1.6 多克隆抗体效价的测定利用间接ELISA方法测定多克隆抗体的效价。用0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液稀释纯化的pCold-Ⅰ-p72蛋白包被，包被量200 ng/孔。用PBST（PBS中加0.5%Tween-20）稀释的5%脱脂乳作为封闭液进行封闭，200 μL/孔。一抗为眼球采血所得血清。将血清从1∶100～1∶100 000进行梯度稀释，阳性对照为空白小鼠血清，100 μL/孔加样。二抗用5%的脱脂乳按一定比例稀释，然后100 μL/孔加样。最后用酶标仪在OD450处读数，记录对照和样品的吸光度。
1.7 p72重组蛋白多克隆抗体效果检测
1.7.1 Western blot检测p72重组蛋白多克隆抗体效果 为验证多克隆抗体的特异性，用制备的重组蛋白多克隆抗体去检测纯化的 p72 重组蛋白和 pCold-I 空载体标签蛋白。煮样后，进行SDS-PAGE蛋白电泳，随后转印至NC膜上，5%脱脂乳封闭后，用采集的小鼠血清作为一抗，验证制备的多克隆抗体的效果。
1.7.2 间接免疫荧光实验检测p72重组蛋白多克隆抗体效果 用制备的p72重组蛋白多克隆抗体和空白阴性对照小鼠血清进行间接免疫荧光（immunofluorescence assay，IFA）实验，检测多克隆抗体的特异性。将构建的 pCAGGS-p72 真核表达质粒和 pCAGGS 空质粒分别转染到 293T 细胞，5% BSA封闭后，将采集的小鼠血清作为一抗，验证制备的多克隆抗体的效果。
2.1 重组原核表达载体pCold-Ⅰ-p72的鉴定ASFV
B646L基因PCR扩增结果可知，在1941 bp处有1条特异性条带，而阴性对照无特异性条带（图1）。用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对构建的重组原核质粒pCold-Ⅰ-p72进行双酶切，出现与预期大小一致的两条条带（图2），结合测序结果显示完全正确，确定成功构建了重组原核表达载体pCold-I-p72。
图1 ASFV B646L基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification result of ASFV B646L gene
图2 重组质粒pCold-Ⅰ-p72酶切鉴定Fig.2 Digestion identification of recombinant plasmid pCold-Ⅰ-p72
2.2 重组原核表达载体pCold-Ⅰ-p72的诱导表达SDS-PAGE结果表明，IPTG诱导rP72蛋白表达后，显示rP72蛋白主要以融合蛋白形式在包涵体中表达，分子量约为72 kDa（图3），与预期大小一致。
图3 rp72蛋白诱导表达鉴定Fig.3 Expression identification of rp72 recombinant protein
2.3 重组蛋白的纯化纯化的重组蛋白rp72，经SDSPAGE电泳分析，出现较为单一的特异性条带，大小约72 kDa（图4）。
图4 重组蛋白rp72的纯化Fig.4 Purification of recombinant rp72 protein
2.4 Western blot分析重组蛋白的多克隆抗体为验证多克隆抗体的特异性，用制备的重组蛋白多克隆抗体去检测纯化的rp72蛋白与pCold-Ⅰ载体标签蛋白。结果显示，免疫后小鼠血清可识别纯化的rp72蛋白（图5）。
图5 重组蛋白rp72的Western blot检测Fig.5 Western blot detection of rp72 protein
2.5 间接免疫荧光实验检测重组蛋白的多克隆抗体通过间接免疫荧光（immunofluorescence assay, IFA）检测多克隆抗体的特异性。将构建的pCAGGS-p72真核表达质粒和pCAGGS空质粒分别转染到293T细胞。IFA检测结果显示，以重组P72蛋白为抗原制备的多克隆抗体能够特异性识别293T细胞中表达的p72蛋白，而转染空质粒的空白对照无任何反应（图6）。
图6 rp72重组蛋白的间接免疫荧光检测Fig.6 Indirect immunofluorescence assay analysis of rp72 protein with polyclonal antibodies
2.6 p72重组蛋白多克隆抗体效价的测定用纯化的pCold-I-p72 蛋白包被板子进行间接 ELISA 测定多克隆抗体的效价。经计算此研究制备的鼠抗ASFV p72蛋白多克隆抗体血清平均效价为1∶10 000。
非洲猪瘟是一种对养猪业危害严重的疫病，自从非洲猪瘟传入中国以来，该病在全国迅速扩散，给中国生猪产业造成了巨大经济损失[12]。目前还没有有效的控制非洲猪瘟的疫苗[13-14]，该病目前的防控措施主要靠检疫[15]，因此，建立快速、准确的实验室检测方法有助于ASF的及早发现与早期控制。
目前，在ASFV的血清学诊断中，具有诊断意义的主要蛋白有p72、p54、pp62和p30蛋白。p72蛋白是ASFV的主要结构蛋白，免疫原性好，保守性强[16]。p72蛋白是在病毒感染后半阶段产生的，约占病毒粒子蛋白的32%，同时也是病毒粒子二十面体线轴的重要部分[17]。p72蛋白能够抑制病毒与细胞结合。研究结果表明，不同地区由ASFV毒株诱导的p72抗体的相应抗原表位均相当保守[18]。
本研究通过构建ASFV的B646L基因的原核表达质粒，通过IPTG诱导表达其编码的p72蛋白。将得到的p72蛋白纯化后，作为抗原免疫BALB/c小鼠，制备p72蛋白的多克隆抗体，经实验室技术分析，制备的单克隆抗体具有较好的反应性和特异性，为建立快速、特异的血清学诊断技术奠定基础。
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