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张子杭, 成元华, 2, 李小梅
胃癌起源于胃表层黏膜[1-2］。侵袭和转移是病人死亡的主要原因[3］。胃癌的发病率逐年升高, 在全球癌症死亡率中排第二[4］, 但其确切发病机制仍未完全阐明。研究发现转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）信号通路参与了胃癌的发生发展[5］, 胃癌病人TGF-β1（TGF-β通路激活剂）的高表达可能与病人预后差相关[6-7］。当给予外源性TGF-β1时, 肿瘤细胞的生长速度、侵袭能力和转移能力均增加[8］。TGF-β1通过促进肿瘤间质中血管的生长从而增强胃癌细胞侵袭能力, SB431542可抑制激活素受体样激酶（activin receptor-like kinase, ALKs）活力, 是ALK家族中ALK-5（TGF-βI型受体）的有效抑制剂, SB431542使胞内信号蛋白Smad2和Smad3不能被激活, 进一步抑制其磷酸化过程, TGFβ信号通路因此被阻断。TGF-β信号通路已被证实参与体内上皮-间充质转化（endothelial-mesenchymal transition, EMT）的激活[9］。TGF-β信号转导通路通过Smads的中间传导, 使信号得以从细胞外部传入到细胞内部, 是TGF-β信号通路传导的关键。相关研究提示, EMT诱导转录因子Slug在高分化胃癌中低表达, 在低分化胃癌中高表达, 而上皮钙黏素（E-cadherin, E-cad）的表达则与之相反, 不难推测胃癌恶性程度与slug蛋白的表达程度成正比, 而与E-cad表达程度成反比。本研究于2021年1月至2022年1月, 旨在探讨TGF-β信号通路对胃癌HGC-27细胞增殖侵袭能力、slug和E-cad蛋白表达的影响, 以期进一步为阐明胃癌的发病机制, 充实实验依据。
1.1 材料
1.1.1 细胞系及细胞培养相关试剂 胃癌HGC-27细胞系购自上海传秋生物公司；
细胞培养相关试剂购自KATAWA。
1.1.2 实验主要试剂 TGF-β1购自美国Enzo, TGF-β通路阻滞剂SB-431542购自MedChemExpress, 二甲基亚砜（DMSO）购自Solarbio Technology公司, 细胞计数试剂盒（CCK-8）购自大连美伦生物科技公司, 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自上海康朗生物科技公司, RIPA细胞裂解液购自索莱宝科技公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 配置88%RPMI 1640+11%胎牛血清（FBS）+1%双抗体成分的完整细胞培养基（KATAWA有限公司）, 在37 ℃、5%二氧化碳恒温培养箱中培养。
1.2.2 体外实验分组 根据对细胞给药不同进行分组：（1）空白对照组：仅使用等量常规培养基；
（2）激 动 剂 组：TGF-β1（25 μg/L）；
（3）阻 断 剂 组：SB431542（2 mg/L）；
（4）激动剂+低浓度阻断剂组：TGF-β1（25 μg/L）+SB431542（2 mg/L）；
（5）激动剂+高浓度阻断剂组：TGF-β1（25 μg/L）+SB431542（4 mg/L）。
1.2.3 CCK-8检测体外细胞增殖活性 培养胃癌细胞系HGC-27后, 共分为五组, 每组设置5个复孔。使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性, 在96孔板中配置100 μL细胞悬液。将培养板放入37 ℃, 5%二氧化碳培养箱中培养24 h。根据分组情况, 每孔加入试剂10 μL, 分别于0、6、12、24、48和72 h时行CCK-8法检测。测量450 nm处的吸光度。
1.2.4 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力 配置基质胶, 使其达到基质胶∶PBS=1∶8的比例, 将人胃癌HGC-27细胞以5×104个/孔的密度接种于96孔培养板中, 置于细胞培养箱中培养24 h后, 按照分组加入药物, 在Transwell小室的上室膜上用棉签均匀涂抹预先配置好的基质胶, 37 ℃条件下放置30 min, 小室的下室中加入500 μL完全培养基, 上室中加入200 μL按照分组处理后的细胞悬液（无血清）。37 ℃过夜, 弃去孔中培养液, 使用PBS润洗2遍, 用棉签轻轻擦去上层未迁移细胞, 甲醛固定30 min, 将小室适当风干。用0.1%结晶紫染色30～60 min, 用PBS洗3遍。用棉签轻轻擦掉上室水分。于倒置显微镜下观察计数。
1.2.5 ELISA试剂盒检测不同组细胞slug和E-cad蛋白表达情况 使用PBS清洗培养瓶中的细胞, 冰浴条件下加入300 μL RIPA细胞裂解液, 反复铺匀10 min, 刮取细胞后转移至冰浴下的离心管中吹打数次, 持续裂解10 min, 裂解完成后12 000g, 4 ℃, 离心5 min, 吸取上清, 上清液使用ELISA试剂盒检测, 标准孔各加50 μL不同标准浓度；
分别设置待测空白孔和样品孔。稀释后, 样品的最终稀释度为5倍。加入100 μL酶标试剂, 密封避光, 37 ℃孵育60 min, 弃去液体, 洗涤5次, 显色后在450 nm波长处测量各孔的吸光度。根据试剂盒说明书绘制标准曲线从而计算各组细胞总蛋白中slug和E-cad蛋白浓度。
1.3 统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示, 多组间比较采用单因素方差分析,P＜0.05表示差异有统计学意义。
2.1 TGF-β通路对HGC-27细胞体外增殖活性的影响使用CCK-8对细胞进行增殖活性检测后, 结果显示：在12 h内, 各组之间增殖能力几乎没有差别（P＞0.05）；
24 h后激动剂组细胞增殖能力强于空白对照组（P＜0.05）；
阻断剂组细胞增殖活性在24 h后低于空白对照组（P＜0.05）；
激动剂+高浓度阻断剂与激动剂+低浓度阻断剂两组的细胞增殖活性在24 h内与空白对照组相比较, 差异无统计学意义（P＞0.05）, 在24 h后两组增殖活性出现明显下降, 但与空白对照组相比较, 差异无统计学意义（P=0.181）。见表1。
表1 TGF-β通路促进胃癌HGC-27细胞增殖活性/±s
表1 TGF-β通路促进胃癌HGC-27细胞增殖活性/±s
注：TGF-β为转录生长因子β。①与空白对照组比较,P＜0.05。
组别空白对照组激动剂组阻断剂组激动剂+低浓度阻断剂组激动剂+高浓度阻断剂组F值P值重复次数5 5 5 5 5 0 h 0.42±0.13 0.41±0.16①0.41±0.13①0.40±0.13①0.40±0.16①10.02 0.785 6 h 0.43±0.15 0.58±0.13①0.41±0.13①0.43±0.12①0.43±0.11①40.25 0.348 12 h 0.51±0.13 0.59±0.14①0.43±0.14①0.52±0.19①0.51±0.14①105.16 0.193 24 h 0.52±0.10 0.70±0.13①0.50±0.11①0.55±0.13①0.42±0.16①431.49 0.001 48 h 0.57±0.11 0.72±0.12①0.32±0.16①0.59±0.11①0.41±0.13①316.48 0.013 72 h 0.59±0.13 0.81±0.13①0.38±0.11①0.43±0.13①0.38±0.16①441.25 0.001
2.2 使用Transwell侵袭实验检测体外培养人胃癌HGC-27细胞侵袭能力变化各组细胞使用药物处理24 h后, 于倒置显微镜下观察到, 细胞穿过小室膜的细胞数量激动剂组多于空白对照组, 阻断剂组低于空白对照组, 均差异有统计学意义（均P＜0.05）；
而激活剂+高浓度阻断剂组和激活剂+低浓度阻断剂组与空白对照组相比较, 差异无统计学意义（P=0.179）。见表2。
表2 TGF-β通路激活和阻断后胃癌HGC-27细胞侵袭能力的变化/（个,±s）
表2 TGF-β通路激活和阻断后胃癌HGC-27细胞侵袭能力的变化/（个,±s）
注：TGF-β为转录生长因子β。①与空白对照组比较,P＜0.05。
组别空白对照组激动剂组阻断剂组激动剂+低浓度阻断剂组激动剂+高浓度阻断剂组F值P值重复次数5 5 5 5 5细胞迁移数117.81±3.11 227.45±5.46①68.47±3.36①113.84±5.21①115.19±5.12①479.15 0.001
2.3 ELISA检测体外培养HGC-27细胞的slug和E-cad蛋白的表达情况激动剂组的slug蛋白表达水平高于空白对照组（P=0.001）；
阻断剂组slug蛋白表达水平低于空白对照组和激动剂组（P＜0.000 1）；
激动剂+高浓度阻断剂组slug蛋白表达水平低于激动剂组（P=0.009）。激动剂组E-cad蛋白水平低于空白对照组（P＜0.000 1）；
阻断剂组E-cad蛋白浓度高于其他组（P＜0.000 1）。见表3。
表3 TGF-β通路激活促进slug蛋白表达并抑制E-cad表达/±s
表3 TGF-β通路激活促进slug蛋白表达并抑制E-cad表达/±s
注：TGF-β为转录生长因子β, slug为slug蛋白, E-cad为上皮钙黏素。①与空白对照组比较,P＜0.05。
组别空白对照组激动剂组阻断剂组激动剂+低浓度阻断剂组激动剂+高浓度阻断剂组F值P值重复次数55555 Slug 101.25±20.11 149.45±24.46①43.16±10.26①87.46±15.21①74.22±10.12①447.59 0.007 E-cad 41.56±25.26 23.54±9.42①138.55±20.44①38.46±10.52①34.16±10.22①347.26 0.011
TGF-β信号转导通路在不同肿瘤中都通过EMT促进肿瘤发生、转移[10］, 相关研究表明, 激活该信号通路后, 上皮细胞获得侵袭特性[11］, 其生长速度和转移能力得到提高[12］。在TGF-β信号通路中, Smads蛋白家族界导了TGF-β信号从细胞外进入细胞核的过程[13］, 从而诱导肿瘤细胞EMT的进展, 调节肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、衰老、迁移等[14］。
EMT主要特征是上皮细胞标志物E-cad表达降低[15］, 正常生理条件下, E-cad表达于各类正常上皮细胞[16］, 在维持细胞的极性和组织结构的完整性中起重要作用[17］。slug是诱导EMT发生的一种转录因子, 同时也是E-cad的上游转录因子[18］, 相关研究中发现, slug转录因子的表达情况往往与E-cad表达情况相反。
本实验使用研究较少的人胃癌HGC-27细胞系, 丰富了TGF-β通路研究的实验基础, 旨在通过外源性药物激活和阻断TGF-β信号通路, 观察胃癌细胞在体外增殖和侵袭能力的变化以及EMT过程中相关基因slug与E-cad的蛋白表达水平的变化。
最新研究结果显示, 纺锤体蛋白 1（SPIN1）的表达情况与密封蛋白1（Claudin-1）成反比[19］, 而 Claudin-1本身是上皮细胞中slug家族的直接下游靶基因[20］。因此可推测SPIN1蛋白通过作用于slug蛋白而调节Claudin-1的表达, Claudin-1蛋白的表达与EMT具有相当紧密的关系, 而EMT的发展过程与Ecad和N-cad的蛋白表达具有直接关系[21］, 因此可以认为, SPIN1蛋白与E-cad和N-cad蛋白在促癌过程中以某种方式相互作用, 具体作用方式目前尚未知晓, 而slug蛋白的表达在其中具有重要作用[22］。
相关研究显示, 30%的胃癌组织均显示出slug表达呈阳性[23］, 而在之后的研究中显示约75%的胃癌病人均存在slug表达阳性[24］。这两项研究结果存在较大差异的原因可能是：后者的研究中包含了更多的晚期胃癌病人。在早期的研究中, 大约60%的病人处于Ⅰ期, 而后者的研究中只有大约30%的病人处于Ⅰ期。提示slug在一定程度上可用于判断胃癌的发展情况。slug在EMT诱导中具有公认的作用[25］, 因此本实验研究了slug蛋白表达情况与E-cad蛋白的表达关系。
本研究发现：使用TGF-β通路激活剂TGF-β1激活该通路后, slug蛋白表达上升, 而E-cad蛋白表达下降, 肿瘤细胞增殖与侵袭能力均上升。使用TGFβ通路阻断剂SB431542阻断该通路后, slug蛋白表达下降, 而E-cad蛋白表达水平上升, 肿瘤细胞的增殖与侵袭能力均下降。在激动剂+低浓度阻断剂和激动剂+高浓度阻断剂组两组中, 随阻断剂浓度的提高, 通路的激动效果下降, 激动剂+高浓度阻断剂组的slug蛋白表达水平低于激动剂+低浓度阻断剂组, 而E-cad蛋白表达水平高于激动剂+低浓度阻断剂组；
肿瘤细胞的增殖与侵袭能力也低于激动剂+低浓度阻断剂组。从而可见：阻断与激活TGF-β通路能够改变slug与E-cad蛋白的表达情况, 随slug蛋白与E-cad蛋白表达情况发生改变, 肿瘤的增殖与侵袭能力发生改变, 说明在该通路中slug与E-cad两种蛋白之间呈负相关, 且TGF-β通路激活水平与细胞增殖和侵袭能力成正比。
以往研究发现TGF-β1具有能够促进胃癌SGC-7901细胞系增殖能力的作用[26］, 肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）是体内TGF-β1的主要来源[27］, 耗竭TAMs后, TGF-β1的数量下降约7倍, 而肿瘤细胞的增殖能力显著下降[28］, 但具体作用机制仍然不清楚。slug在恶性肿瘤中过度表达, 并能上调细胞内血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表达, 干扰slug能起到抑制胃癌血管生成的作用[29］。本研究观察到, 使用TGF-β1激活TGF-β通路后, slug蛋白表达显著升高, 并增强了胃癌HGC-27细胞的增殖能力, 而在阻断TGF-β通路后细胞增殖活性明显下降, slug蛋白表达下降, 可以推测TGF-β1是通过激活TGF-β通路, 促进血管生成从而增强细胞增殖活性。
Matrigel在Transwell侵袭实验中充当了体内ECM的作用, 细胞穿过小室膜不仅仅反映了细胞的运动能力, 同时也反映了其分泌MMPS溶解ECM的能力。本研究使用Transwell侵袭实验检测人胃癌HGC-27细胞的侵袭能力时, 激动剂组的细胞相较于其余各组均发挥出了较强的侵袭能力。同时测得激动剂组细胞E-cad表达下降, 推测当使用TGF-β1激活通路后, E-cad表达的下降不仅会导致细胞失去极性、降低细胞连接稳定性[30］, 同时还会使胃癌细胞分泌更多的MMPS[31］, 溶解掉ECM, 从而增强了胃癌细胞的侵袭能力。
在使用CCK-8检测人胃癌HGC-27细胞的增殖能力时, 我们发现所有组别的HGC-27细胞在起初24 h均表现为快速增殖, 而添加了阻断剂组的细胞在接下来的48 h和72 h表现为增殖活性的明显下降, 可能提示SB431542的起效时间往往需要24 h以上。预实验中发现：当TGF-β1浓度高于40 μg/L和低于10 μg/L时, 激动剂组HGC-27细胞的增殖活性不增高反而降低, 这意味着较高和较低浓度的TGFβ1可抑制胃癌细胞增殖, 提示TGF-β1的作用效果与浓度相关。在激动剂TGF-β1（50 μg/L和10 μg/L）+阻断剂SB431542（2 mg/L）的非最佳浓度组中, 观察到TGF-β1和SB431542共同抑制细胞增殖, 且其抑制程度大于SB431542（2 mg/L）单药组, 提示TGF-β1在某些浓度下可与SB431542共同作用从而阻断TGF-β通路并抑制人胃癌HGC-27细胞的增殖。
综合本研究和文献报道可知, 当TGF-β通路被激活后, 活化的TGF-β受体1将Smad2和Smad3磷酸化, 磷酸化的Smad2和Smad3与Smad4组装成异二聚体和三聚体复合物, 然后进入细胞核[32］, 直接与slug的启动子结合以诱导其转录, 促使slug结合E-cad基因CDH1的启动子, 抑制E-cad蛋白的编码而促进EMT的进展, 导致N-cad的表达上升、E-cad的表达下降, TGF-β信号通路可改变slug和E-cad蛋白的表达情况, 从而调节胃癌细胞增殖和侵袭能力, 而TGF-β1和SB431542在体外实验中发挥的作用与药物剂量和二者间相互作用有关。
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