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陈思思，金育，张玉芳，何春艳，周正淼，刘野
中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，云南 昆明 650118
随着人们对免疫系统认识的深入以及科技的发展，现有疫苗形式变得多样化。根据不同病原体的传染风险与自身特性的差异，可选择不同抗原形式作为疫苗免疫原成分，如不使用完整的病毒体，而选择特定的蛋白区域、核酸片段等作为免疫原；
如乙型肝炎表面抗原重组疫苗和以L1晚期蛋白病毒样颗粒为抗原的HPV疫苗等［1⁃3］。与经典疫苗相比，重组蛋白亚单位疫苗与核酸疫苗等更加安全且利于大规模生产，但因其免疫原性较弱，通常需要佐剂来增强免疫应答能力或改变免疫应答类型［4⁃5］。佐剂是一种能够通过增强免疫反应并改变免疫反应的类型来促进抗原特异性免疫应答的非特异性免疫增强剂，通常可减少抗原用量及免疫次数，产生更快速和持久的免疫反应，提高疫苗的免疫反应强度及有效性。传统的铝佐剂引起的细胞免疫反应较弱，佐剂功能受限，近期已被批准使用的佐剂如MF59、AS01和AS03等，在我国均缺乏自主知识产权［6⁃8］。因此，迫切需要研发出新型、强效并有自主知识产权的佐剂应用于疫苗研究。而一种获批的药物或生物制剂如佐剂等，往往需要数年甚至数十年研发历程。为节省研发周期，研究者们通常会选择一些已获批的分子作为母体，进行修饰改造以改善耐药性或开拓其他功效［9⁃11］。
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS⁃CoV⁃2）引起的新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID⁃19）在世界范围内暴发流行，严重威胁人类公共健康安全［12⁃13］。新冠疫苗的研发是近两年来的热点，SARS⁃CoV⁃2的刺突蛋白受体结合域（receptor⁃binding do⁃main，RBD）与人体中的受体血管紧张素转换酶2（an⁃giotensin⁃converting enzyme 2，ACE2）结合，并介导病毒附着侵入感染［14⁃15］。宿主感染SARS⁃CoV⁃2后，RBD蛋白在诱导中和抗体和T细胞应答以及保护性免疫中起关键作用，为阻止SARS⁃CoV⁃2入侵，研究人员将RBD蛋白作为疫苗研发的抗原［16⁃17］。
金刚烷胺是已被美国食品药品监督管理局批准用作抗病毒和抗帕金森病的药物，具有良好的生物安全性［18⁃19］。本研究选择金刚烷胺作为母体分子，通过化学连接形成金刚烷胺二聚体化合物，并探讨金刚烷胺二聚体在新冠RBD蛋白疫苗中能否作为新型佐剂来增强体液免疫应答强度。
1.1 主要试剂及仪器2⁃（7⁃氮杂苯并三氮唑）⁃N，N，N"，N"⁃四甲基脲六氟磷酸酯［2⁃（7⁃azabenzotriazol⁃1⁃yl）⁃N，N，N"，N"⁃tetramethyluronium hexafluorophosphate，HATU］、N，N⁃二异丙基乙胺（N，N⁃diisopropylethyla⁃mine，DIPEA）、氢氧化钠（NaOH）、盐酸（HCl）、乙醇（EtOH）和N，N⁃二甲基甲酰胺（N，N⁃dimethylforma⁃mide，DMF）购自阿达玛斯试剂（上海）有限公司；
1，4（1，4）⁃dibenzenacyclohexaphane⁃12，43⁃diol购自大赛璐药物手性技术（上海）有限公司；
碳酸铯（Cs2CO3）购自TCI（上海）化成工业发展有限公司；
金刚烷胺、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；
氯乙酸甲酯购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；
氢氧化铝佐剂购自北京索莱宝科技有限公司；
SARS⁃CoV⁃2的RBD蛋白购自北京义翘神州生物技术有限公司；
辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自安诺伦（北京）生物科技有限公司；
酶标仪购自德国CLARIO star公司；
旋转蒸发仪购自德国Heidolph公司。
1.2 实验动物SPF级BALB／c小鼠，雌性，6~8周龄，体质量约22 g，购自中国医学科学院医学生物学研究所，实验动物许可证：SYXK（滇）K2018⁃0007。所有动物实验均经医学生物学研究所动物伦理委员会批准，动物伦理审查编号为：DWSP202⁃108010。
1.3 金刚烷胺二聚体的合成 合成路线见图1。样品鉴定由云南大学现代仪器分析测试中心完成。
图1 金刚烷胺二聚体的合成路线Fig.1 Synthetic route of amantadine dimer
第一步，取代反应过程：称量20 mg底物S1［即1，4（1，4）⁃dibenzenacyclohexaphane⁃12，43⁃diol］，加至装有磁力搅拌子的圆底烧瓶中，用3 mL无水DMF溶解后，加入氯乙酸甲酯（80 μL，0.91 mmol）和Cs2CO3（137 mg，0.42 mmol），油浴60℃下搅拌反应20 h；
过滤反应物，除去Cs2CO3，用水／乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯相产物；
用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得到的产物利用电喷雾电离质谱（electrosprayionization⁃MS，ESI⁃MS）正离子模式进行化合物鉴定。
第二步，水解酸化反应过程：将上一步获得的化合物作为第二步反应的底物S2，用乙醇重新溶解，并加入166.2 mg NaOH，1~2 h 后终止反应；
用水／乙酸乙酯萃取，保留水相产物；
加入HCl 调pH 为5，再次用水／乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯相产物；
用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得到的产物利用ESI⁃MS 负离子模式进行化合物鉴定。
第三步，酰胺缩合反应过程：将上一步获得的化合物作为第三步反应的底物S3，将30 mg S3 溶解于2 mL 无水 DMF 中，搅拌下加入金刚烷胺（50 mg，0.327 mmol）、HATU（19.21 mg，0.051 mmol）和 DIPEA（17.6 μL，0.101 mmol），反应18~24 h；
用水／乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯相产物；
用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩；
经薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）进行纯化，并利用ESI⁃MS正离子模式进行终产物鉴定。
1.4 动物免疫 将BALB／c小鼠随机分为5组，每组6只：①R6A+RBD 组：取21 μg（0.033 μmol）R6A与10 μg RBD混合，终体积为100 μL。现用现配；
②Ada+RBD组：取10 μg（0.066 μmol）金刚烷胺与10 μg RBD混合，终体积为100 μL，现用现配；
③Alu+RBD 组：取 35 μg 氢氧化铝佐剂与 10 μg RBD 混合，终体积为100 μL，用前2 h配制；
④RBD 组：10 μg RBD，体积为100 μL；
⑤Blank 组：0.9%生理盐水，体积为100 μL，作为阴性对照。分别在第0、14 和28 天肌肉注射免疫小鼠。于第2次免疫后7 d和末次免疫后14 d，经尾静脉采血，分离血清。
1.5 小鼠血清特异性IgG抗体水平检测 采用ELISA法。用 RBD 蛋白（5 μg／mL）包被 96 孔板，50 ~100 μL／孔，置4 ℃包被过夜；
控干板内液体，PBST（0.01 mol／L PBS + 0.05% Tween）洗板4 ~ 5 次，拍干板底水分，加入含1% BSA 的PBS，37 ℃封闭2 h；
控干板内液体，PBST洗板4~5次，拍干板底水分，加入倍比稀释（1∶10 000 ~ 1∶160 000）的待测血清，37 ℃孵育 2 h；
控干板内液体，PBST 洗板4~5 次，拍干板底水分，加入HRP 标记的羊抗鼠IgG（1∶5 000稀释），37 ℃孵育1 h；
控干板内液体，PBST 洗板4 ~5 次，拍干板底水分，加入 3，3"，5，5"⁃四甲基联苯胺（TMB）与过氧化氢（H2O2）混合液作为显色底物，100 μL／孔，37 ℃孵育 8 ~ 10 min；
加入 1 mol／L H2SO4，100 μL／孔，终止显色。于酶标仪450和630 nm波长处，检测各孔A值。
1.6 统计学分析 应用GraphPad Prism软件（GraphPad，San Diego，CA，USA），组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 金刚烷胺二聚体合成中取代反应连接结果 完成第一步取代反应后，得到的产物化学名称为dimethyl 2，2"⁃［1，4（1，4）⁃dibenzenacyclohexaphane⁃12，43⁃diylbis（oxy）］diacetate，化学式为C22H24O6，精准分子量（Exact Mass）为384.16，命名为1Y。采用正离子模式进行ESI⁃MS检测，扫描范围为80~680 m／z。根据质谱结果［M+H］+为 385.1651 和［M+Na］+为407.146 8，说明反应获得了目标产物。见图2。
图2 取代反应产物1Y质谱图Fig.2 Mass spectrum of product 1Y of substitution reaction
2.2 金刚烷胺二聚体合成中水解酸化反应连接结果完成第二步水解酸化反应后，得到的产物化学名称为 2，2"⁃［1，4（1，4）⁃dibenzenacyclohexaphane⁃12，43⁃diylbis（oxy）］diacetic acid，化学式为C20H20O6，Exact Mass为356.13，命名为20⁃Cl。采用负离子模式进行ESI⁃MS检测，扫描范围为125~775 m／z。根据质谱结果［M⁃H］-为355.118 6，说明反应获得了目标产物。见图3。
图3 水解酸化反应产物20⁃Cl质谱图Fig.3 Mass spectrum of product（20 ⁃Cl）of hydrolysis and acidification reaction
2.3 金刚烷胺二聚体合成中酰胺缩合反应连接结果完成第三步酰胺缩合反应后，得到的产物化学名称为 2，2"⁃［1，4（1，4）⁃dibenzenacyclohexaphane⁃12，43⁃diylbis（oxy）］bis{N⁃［（3s，5s，7s）⁃adamantan⁃1⁃yl］acetamide}，化学式为C40H50N2O4，Exact Mass为622.38，命名为R6A（即金刚烷胺二聚体终产物）。采用正离子模式进行ESI⁃MS检测，扫描范围为200~1 300 m／z。根据质谱结果［M+H］+为623.384 6 和［2M+Na］+为1 267.744 0，说明反应获得了目标产物。见图4。
图4 水解酸化反应产物R6A质谱图Fig.4 Mass spectrum of product R6A of hydrolysis and acidification reaction
2.4 小鼠血清特异性IgG抗体水平
2.4.1 2次免疫后小鼠血清抗体水平 结果显示，R6A+RBD 组各稀释度小鼠血清抗体水平均高于Ada +RBD组，但均低于Alu+RBD组。血清稀释度1∶10 000时，R6A+RBD 组与 Ada+RBD 组比较，差异有统计学意义（F=32.21，P<0.05）；
血清稀释度为1∶80 000和 1∶160 000 时，R6A + RBD 组与 Alu + RBD 组比较，差异均有统计学意义（F分别为15.19 和17.71，P均<0.05）。见图5。表明R6A可作为新型佐剂增强新冠蛋白疫苗的免疫应答潜力。
图5 2次免疫后小鼠血清抗体水平Fig.5 Serum antibody level of mice after two doses of immu⁃nization
2.4.2 3 次免疫后小鼠血清抗体水平 结果显示，3次免疫后R6A+RBD 组各稀释度小鼠血清抗体水平均高于Ada+RBD 和Alu+RBD 组，且差异均有统计学意义（F均 >30，P均<0.000 1和 <0.01），见图6。表明R6A的佐剂效用呈剂量依赖性。
图6 3次免疫后小鼠血清抗体水平Fig.6 Serum antibody level of mice after three doses of imm⁃unization
截至目前，已有70 多种疫苗被批准用于预防约30种病原体。尽管如此，要研发更安全、更有效且低成本的疫苗仍然面临挑战［6，20⁃21］。随着生物技术领域的发展，可选择更安全的亚单位如蛋白质、多肽等作为疫苗抗原，但这类疫苗往往免疫原性较弱，需要有效的佐剂来增强其免疫反应［5，22⁃23］。
基于前期对金刚烷胺的研究基础，发现对金刚烷胺进行修饰后，能增强其佐剂效应［24⁃25］。因此，本研究选择以金刚烷胺作为母体分子，合成金刚烷胺二聚体，并探讨新型金刚烷胺二聚体佐剂对新冠蛋白疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响。结果表明，2次免疫后，金刚烷胺二聚体诱导小鼠体液免疫应答水平高于金刚烷胺单体，但低于铝佐剂；
而3次免疫后，金刚烷胺二聚体诱导小鼠体液免疫应答水平均高于金刚烷胺单体和铝佐剂。表明金刚烷胺二聚体佐剂能够提高新冠蛋白疫苗诱导小鼠体液免疫应答的能力，具有良好的佐剂效应，可作为备选佐剂，这种基于现有药物改造的策略为开发新型佐剂提供了新思路。
综上所述，金刚烷胺二聚体可作为一种新型候选佐剂，对体液免疫应答的提高具有明显的剂量依赖性，体现了加强免疫的重要性，但这种依赖性增强的机制目前尚不清楚，对于细胞免疫的作用也有待进一步研究。除此之外，本研究仅探讨了该佐剂在新冠蛋白疫苗中的作用，有望应用于其他多种病原体、多种形式的疫苗，以扩大其应用范围。
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