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郝晋芳，孙晨曦，杜建平，韩倩，张晓延
1.山西医科大学汾阳学院医学检验系，山西 汾阳 032200；
2.山西医科大学研究生院，山西 太原 030001
肠道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）是引起小儿手足口病（hand⁃foot⁃and⁃mouth disease，HFMD）的主要病原体［1］。自2008年将HFMD 纳入法定报告的丙类传染病以来，其发病率呈逐年上升趋势。细胞凋亡是由基因调控的细胞程序性死亡方式之一［2］。病毒感染多引起细胞损伤，而此类病变以细胞程序性死亡方式中的细胞凋亡常见。细胞自噬是机体在应激状态下维持机体稳态的一种方式［3］。黄芪（as⁃tragalus membranaceus，AM）注射液作为一种传统中药制剂，具有增强免疫力、抗心肌损伤、抗氧化损伤、抗肿瘤、抗病毒等作用［4⁃8］。有研究表明，AM 可抑制红比霉素诱导的新生儿心肌细胞凋亡［9］。本研究旨在探讨AM 能否抑制EV71 感染引起的细胞凋亡从而减轻染毒组细胞的病变效应及其机制，进而在病毒感染中发挥保护作用。
1.1 病毒及细胞 EV71（Fuyang⁃0805）由中国医学科学院北京协和医学院赵振东教授惠赠，临床分子诊断学实验室扩增；
人胃上皮细胞GES⁃1 由山西医科大学汾阳学院张笑添老师惠赠，临床分子诊断学实验室液氮保存，用含10%血清的DMEM培养基培养。
1.2 主要试剂及仪器 DMEM 培养基、胰蛋白酶和BCA 蛋白测定试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司；
胎牛血清购自以色列BI 公司；
DAPI 细胞核染料和PARP 兔多抗（AP102）购自碧云天生物技术公司；
CCK⁃8 试剂购自上海翊圣生物科技有限公司；
PAGE凝胶配置试剂购自北京索莱宝科技有限公司；
NC膜购自美国PALL公司；
VP1兔多抗（GTX132338）购自美国GeneTex公司；
Caspase⁃3兔多抗（WL02117）购自万类生物科技有限公司；
P62 兔多抗（ab91526）和 LC3 兔多抗（ab51520）购自美国 Abcam 公司；
β⁃actin 兔多抗（AP0060）购自美国Bioworld 公司；
HRP标记的山羊抗兔IgG（CW0103）购自康为生物技术公司；
黄芪注射液购自正大青春宝药业有限公司，浓度以原药材计；
荧光倒置显微镜（Nikon Ts2R）购自日本Nikon公司；
酶标仪Eon购自美国Bio Tek公司。
1.3 EV71 感染对GES⁃1 细胞形态影响的检测 将GES⁃1细胞接种于24孔板，1 × 105个／孔，37 ℃培养12 h，待细胞贴壁后，按 MOI= 3 感染 EV71，24 h 后，用倒置显微镜观察细胞形态，以未感染病毒的细胞作为对照。
1.4 EV71 感染对 GES⁃1 细胞中 EV71 结构蛋白 VP1表达影响的检测 采用Western blot法。细胞处理方法同1.3项，EV71感染GES⁃1细胞24 h后，收集感染组和对照组细胞，加入RIPA 细胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃，13 300 ×g离心 10 min，收集上清，BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度。提取的蛋白经12%SDS⁃PAGE 分离后，转移至硝酸纤维素膜上，室温封闭2 h；
加入VP1 兔多抗（1∶2 000 稀释），4 ℃摇床过夜；
TBST 洗涤 3 次，每次 10 min，加入 HRP 标记的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀释），室温摇床孵育2 h；
TBST洗涤3 次，每次15 min，用ECL 化学发光液对目的蛋白进行曝光显色。
1.5 EV71 感染对GES⁃1 细胞活力影响检测 采用CCK⁃8 法。将对数生长期的 GES⁃1 细胞接种于 96 孔板，1× 104个／孔，培养12 h后，按MOI=3感染EV71，培养24 h，按下式计算细胞活力。以仅有培养基无细胞组为空白组，未感染病毒的细胞为对照组。
细胞活力（%）=（A感染-A空白）／（A对照-A空白）×100%
1.6 EV71感染对GES⁃1细胞凋亡影响的检测 采用DAPI核染色法。细胞处理方法同1.3 项，EV71 感染GES⁃1细胞24 h后，弃去培养基，PBS洗涤3次，3 min／次，DAPI染色5 min，PBS 洗涤3次，5 min／次，荧光显微镜观察细胞核的形态变化。
1.7 细胞分组给药及凋亡和自噬相关蛋白表达的检测 将 GES⁃1 细胞接种于 6 孔板，1 × 106个／孔，待细胞贴壁后，用 MOI = 1、3、5 的 EV71 分别感染 24 h或用终浓度为1、2.5、5、10 μg／mL的AM分别预处理2 h后，用MOI=3的EV71干预，共培养24 h，Western blot 检测细胞凋亡相关蛋白 Caspase⁃3、PARP 和自噬相关蛋白LC3、P62 的表达，步骤参考1.4 项，一抗稀释比例分别为1∶500、1∶1 000、1∶5 000和1∶5 000。以未感染的细胞作为对照。
1.8 AM 对 EV71 感染的 GES⁃1 细胞活力影响的检测 采用CCK⁃8 法。将对数生长期的GES⁃1 细胞接种于 96 孔板，1 × 104个／孔，培养 12 h 后，用终浓度为 1、2.5、5、10 μg／mL 的 AM 分别预处理2 h，再用MOI=3 的EV71 干预，共培养24 h，以仅有培养基而无细胞组为空白组，有细胞而未干预组为0 加药组。待细胞培养结束前1 h，每孔加入10 μL CCK⁃8试剂，于酶标仪波长450 nm 处测定吸光度（A）值，并按下式计算各孔细胞活力，以对照组细胞为100%作为参照。
细胞活力（%）=（A加药-A空白）／（A0加药-A空白）× 100%
1.9 统计学分析 使用GraphPad Prism 8 软件进行统计学分析，组间均数比较采用t检验，以P< 0.05为差异有统计学意义。
2.1 EV71感染对GES⁃1细胞形态的影响 显微镜下观察可见，与未感染病毒的对照组相比，EV71 感染组细胞变圆、皱缩，悬浮细胞明显增多，细胞病变明显，见图1。
图1 EV71感染GES⁃1细胞的形态学变化（×100）Fig.1 Morphological changes of GES⁃1 cells infected with EV71（× 100）
2.2 EV71 感染对 GES⁃1 细胞中 EV71 结构蛋白 VP1表达的影响 Western blot 分析显示，EV71 感染后，GES⁃1 细胞中 VP1 水平（VP1／β⁃actin=1.048）明显增高（t=41.56，P<0.01），见图2。
图2 Western blot 分析 EV71 感染后 GES⁃1 细胞中 EV71结构蛋白VP1的表达Fig.2 Expression of EV71 structural protein VP1 in GES⁃1 cells infected with EV71 by Western blot
2.3 EV71 感染对 GES⁃1 细胞活力的影响 EV71 感染后，GES⁃1 细胞活力降低为 80.2%（t= 19.07，P<0.01）。
2.4 EV71 感染对GES⁃1 细胞凋亡的影响 荧光显微镜下观察可见，EV71 感染后，细胞核固缩，大小不均，见图3。表明EV71 感染可诱导GES⁃1 细胞凋亡的发生。
图3 EV71感染后GES⁃1细胞核的形态变化（×400）Fig.3 Morphological changes of nuclei in GES⁃1 cells infe⁃cted with EV71（× 400）
2.5 EV71感染对GES⁃1细胞凋亡的影响 与对照组相比，分别用 MOI = 5 的 EV71 感染 GES⁃1 细胞 24 h后，细胞中Caspase⁃3 和PARP 蛋白均发生了明显的剪切（t分别为 35.29 和 3.648，P分别 < 0.01 和 =0.021 8），见图4和图5。表明EV71感染可诱导GES⁃1细胞发生凋亡。
图4 Western blot 分析不同 MOI EV71 感染的 GES⁃1 细胞凋亡相关蛋白的表达Fig.4 Expression of apoptosis⁃related proteins in GES⁃1 cells infected with different MOI EV71 by Western blot
图5 不同MOI EV71 感染的GES⁃1 细胞凋亡相关蛋白的表达量Fig.5 Expression of apoptosis⁃related proteins in GES⁃1 cells infected with different MOI EV71
2.6 EV71感染对GES⁃1细胞自噬的影响 与对照组相比，分别用 MOI = 5 的 EV71 感染 GES⁃1 细胞 24 h后，细胞中LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比例显著增加（t=10.16，P= 0.000 5），P62 蛋白发生了降解（t= 68.68，P<0.01），见图 6 和图7。表明 EV71 感染可诱导 GES⁃1细胞自噬。
图6 Western blot 分析不同 MOI EV71 感染的 GES⁃1 细胞自噬相关蛋白的表达Fig.6 Expression of autophagy⁃associated proteins in GES⁃1 cells infected with different MOI EV71 by Western blot
图7 不同MOI EV71 感染的GES⁃1 细胞自噬相关蛋白的表达量Fig.7 Expression of autophagy⁃associated proteins in GES⁃1 cells infected with different MOI EV71
2.7 AM 对EV71感染的GES⁃1细胞凋亡的影响 与对照组相比，经10 μg／mL AM干预后，细胞中Caspase⁃3和PARP 蛋白的降解均明显减少（t分别为52.66和59.60，P均 <0.01），见图 8 和图 9。表明 AM 可抑制EV71感染诱导的GES⁃1细胞凋亡。
图8 Western blot 分析不同浓度AM 对EV71感染的GES⁃1细胞中凋亡相关蛋白表达的影响Fig.8 Effect of different concentrations of AM on the exp⁃ression of apoptosis⁃related proteins in GES⁃1 cells infected with EV71 by Western blot
图9 不同浓度AM 对EV71 感染的GES⁃1 细胞中凋亡相关蛋白表达量的影响Fig.9 Effect of different concentrations of AM on the exp⁃ression of apoptosis⁃related proteins in GES⁃1 cells infected with EV71
2.8 AM 对EV71感染的GES⁃1细胞自噬的影响 与感染组相比，10 μg／mL AM 干预抑制了EV71 引起的LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比例增加（t= 5.521，P= 0.005 3）和P62的降解（t=40.22，P<0.01），见图10和图11。表明AM可抑制EV71感染引起的GES⁃1细胞自噬。
图10 Western blot 分析不同浓度AM 对EV71 感染的GES⁃1细胞中自噬相关蛋白表达的影响Fig.10 Effect of different concentrations of AM on the exp⁃ression of autophagy⁃related proteins in GES⁃1 cells infected with EV71 by Western blot
图11 不同浓度AM 对EV71感染的GES⁃1细胞中凋亡相关蛋白表达量的影响Fig.11 Effect of different concentrations of AM on the exp⁃ressions of P62，LC3 proteins in EV71 infected GES⁃1 cells
2.9 AM对EV71感染的GES⁃1细胞活力的影响 AM干预可减轻EV71 对GES⁃1 细胞活力的抑制作用（t=4.420，P=0.011 5），见图12。
图12 不同浓度 AM 对 EV71 感染的 GES⁃1 细胞活力的影响Fig.12 Effect of different concentrations of AM on prolif⁃eration of GES⁃1 cells infected with EV71
HFMD 在亚太地区广泛流行，其发病率居于我国丙类传染病之首，对公共卫生造成重大威胁。HFMD主要是由EV71 和柯萨奇病毒A16 型（Coxsackievirus A16，CoxA16）感染引起的一种儿童常见传染病［10］。EV71 感染患者病情进展迅速，常引起神经系统严重并发症，甚至导致死亡［11］，但其发病机制尚未明确，且针对此类疾病仍无特异性的药物。
细胞凋亡作为细胞程序性死亡的一种方式，是机体对入侵病原体的一种免疫反应。Caspase⁃3、PARP蛋白均为凋亡相关蛋白，细胞发生凋亡时，凋亡效应酶Caspase⁃3 在多种蛋白水解酶的作用下，发生裂解而活化，PARP 是凋亡的底物，可被活化的凋亡效用酶剪切。病毒感染诱导细胞凋亡的发生，一方面造成机体损伤，另外也可能是病毒为了逃逸机体免疫反应，更利于其自身复制。研究表明，EV71、HCV、HIV感染均会诱导细胞凋亡的发生［12⁃14］。继往也有研究表明，HCV 通过诱导T 淋巴细胞凋亡，促进自身的复制［15］。EV71 诱导的细胞凋亡会促使 EV71 的释放，使其继续在机体扩散感染，而凋亡抑制剂N⁃苄氧羰基⁃缬氨酰⁃丙氨酰⁃门冬氨酰氟甲基酮（Z⁃VAD⁃FMK）通过抑制EV71感染引起的细胞凋亡，可控制病毒的扩散感染［16］。β⁃硫磺菌素修饰的纳米砷粒子（Se@TP）可抑制甲型流感病毒（H1N1）诱导的细胞凋亡来从而抑制H1N1的复制［17］。
研究发现，中药及其成分具有抗细胞凋亡的作用，如环黄芪醇通过抑制脑缺血引起的细胞凋亡对神经细胞起到保护作用［18］。鞣花酸可抑制糖尿病引起的细胞凋亡［19］。黄芪对流感病毒感染的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞具有保护作用（Raw264.7）［20］。黄芪可抑制小鼠病毒性心肌炎导致的心肌细胞凋亡［21］。黄芪提取物具有抗 H9 禽流感病毒的作用［8］。本研究发现，AM可抑制EV71诱导的细胞凋亡。
细胞自噬是维持细胞稳态高度保守的细胞过程，LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比例增加，标志着自噬的起始，P62作为自噬的底物，其降解标志着自噬进入效应阶段。机体在病原体感染的异常情况下会诱导细胞自噬的发生，如甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）、HCV、H1N1 感染均可诱导细胞自噬的发生［22⁃24］。EV71 感染诱导的细胞自噬，可促进 EV71 的复制［25⁃26］。猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染诱导的细胞自噬也可促进PEDV 的复制［27］。我们前期研究表明，抑制EV71诱导的细胞自噬可抑制EV71 诱导的细胞凋亡［28］。研究中发现，EV71 感染引起人胃上皮细胞GES⁃1 损伤，引起细胞凋亡，而AM可减轻EV71引起的GES⁃1细胞损伤，且AM可抑制EV71 诱导的细胞自噬和凋亡，这可能是AM 通过抑制EV71诱导的自噬进而抑制EV71诱导的细胞凋亡并发挥保护作用，其保护作用的具体机制需继续研究。
综上所述，AM 可抑制EV71 诱导的细胞凋亡和自噬，对EV71 感染引起的细胞损伤起到保护作用。本研究为临床EV71感染的治疗提供了参考。
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