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薛勇 吴雪琼
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染，机体免疫力抵抗不过MTB的毒力，从而发病。传统意义上，我们一直认为结核病是一种MTB感染引起的感染性疾病。随着近些年对结核病患者的相关免疫指标的监测发现，结核病患者存在不同程度上的免疫功能受损，例如结核病患者的外周血CD4+T淋巴细胞的计数较健康对照组下降等。这些发现让我们认识到结核病也是一种免疫性疾病。在对这些免疫功能的监测中，逐步发现，对于这些免疫功能指标的解读存在一定的差异，这些差异一定程度上影响到临床医师对结核病患者进行免疫治疗的决策。为此，中国人民解放军总医院第八医学中心、《中国防痨杂志》编辑委员会、中国医疗保健国际交流促进会结核病防治分会基础和临床学部联合组织专家拟定《活动性结核病患者免疫功能状态评估和免疫治疗专家共识(2021年版)》(以下简称《共识》)[1]。本《共识》主要由结核病患者进行免疫监测和免疫治疗相关的有较高可信度的证据达成，对一些研究较少，可信度一般或较低的相关信息没有纳入。笔者本次对《共识》进行解读，希望可以在《共识》的基础上为读者带来更多研究成果，丰富读者对结核病患者的免疫功能评估和免疫治疗的认识，同时，希望未来可以得到更多的研究与应用，提供更多的循证医学证据，以供未来《共识》修订时使用。
《共识》中推荐的结核病患者免疫功能状态评估方法主要是目前临床常用的结核病免疫检测方法，一方面可辅助结核病诊断，另一方面可了解结核病患者的免疫细胞数量和免疫功能的变化。近年来，免疫功能评价研究取得的新进展将为临床患者提供更多可用的评估指标。
1.血常规：血常规是每例患者就诊时必查的项目，《共识》中推荐从血常规中可了解结核病患者外周血淋巴细胞和单核细胞计数和百分比，可了解适应性免疫和固有免疫细胞的数量，初步判断患者是否存在免疫细胞减少。结核病患者淋巴细胞计数和百分比通常可能低于参考范围下限；
而结核病会使骨髓中单核细胞的产生和释放增加，导致单核细胞计数升高，在免疫细胞耗竭时才会低于参考范围下限。此外，近年研究发现，外周血中性粒细胞/淋巴细胞的比值可能反映结核病患者肺部的空洞情况[2]。Jeon等[3]报道结核病患者中性粒细胞/(淋巴细胞+单核细胞)比值、单核细胞/淋巴细胞比值、血小板/淋巴细胞比值较非结核肺部疾病组明显降低。这些新的指标在临床诊断和鉴别诊断中的应用价值仍待探索，但一定程度上可以辅助了解患者的免疫功能。
2.淋巴细胞亚群及其细胞因子：国内已经对淋巴细胞亚群检测达成了一定共识，详见《结核病患者外周血淋巴细胞亚群检测及临床应用专家共识》[4]。目前，国内部分实验室仍只检测淋巴细胞亚群的百分比，不检测绝对计数，容易对部分淋巴细胞亚群计数减少造成漏检，从而影响临床医生对患者免疫状态的评估。此外，目前绝大多数实验室只检测外周血T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、B细胞百分比及绝对计数，缺乏对它们的精细分型检测。
外周血中单核细胞可通过CD14和CD16分为经典单核细胞(CD14++CD16-)、中间单核细胞(CD14+CD16+)和非经典单核细胞(CD14-CD16++)。经典单核细胞有助于宿主的促炎防御机制，中间单核细胞与抗原递呈相关，非经典单核细胞在血管巡逻和监视中发挥作用[5]。结核病患者外周血中经典单核细胞比例减少，而中间和非经典单核细胞比例较健康组增高[6]。
CD4+T细胞通过其被抗原刺激后产生细胞因子的不同分为1型辅助性T细胞(helper T cell 1，Th1)、Th2、Th17、Th22等亚群；
CD8+T细胞通过其被抗原刺激后产生细胞因子的不同分为1型细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyle 1，Tc1)、Tc2等亚群；
Th1细胞主要分泌γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，通过这些细胞因子增强细胞免疫，来抵抗胞内病原体的感染。Th2细胞通过分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，辅助B细胞活化发挥体液免疫，同时抑制Th1增殖[7]。研究发现，结核病患者的Th1/Th2比值较健康对照组明显下降，说明结核病患者的Th1/Th2平衡被破坏，造成一种免疫抑制状态[8]。Th17细胞主要分泌IL-17和IL-22，参与固有免疫和某些炎症。调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)与Th17相反，主要发挥负向的免疫调控。在抗结核感染中，Th17可以通过趋化中性粒细胞，来促进肉芽肿的形成，Treg在结核感染初期可通过抑制T细胞激活来抑制适应性免疫应答的发挥。结核病患者的外周血中Th17和Treg比例均较健康组升高。在结核性胸膜炎患者的胸腔积液中也观察到Th17/Treg的失衡。初治和复治结核病患者外周血中CD4+Foxp3+Treg细胞的比例较健康对照组升高，并且敏感结核病患者外周血中CD4+Foxp3+Treg细胞的比例较耐多药结核病患者升高，痰涂片阳性结核病患者外周血中CD4+Foxp3+Treg细胞的比例较痰涂片阴性结核病患者升高[9]。这说明结核病患者处于免疫抑制状态，这种状态可能不利于抗结核免疫[6]。
近年来，越来越多的研究关注于结核病患者中协同产生TNF-α、IL-2和IFN-γ的多功能T细胞，它们可能在结核病发病机制中具有保护作用。活动性结核病患者TNF-α+IL-2+IFN-γ+多功能CD4+T细胞和多功能CD8+T细胞的频率明显高于结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)人群，肺结核治愈后减少，有较高比例的IFN-γ单因子表达CD4+T细胞和IL2+IFN-γ+CD4+T细胞[10]。
根据CD45RA和CC趋化因子受体7(CC chemokine receptor 7，CCR7)的表达，可将T细胞分为下列4种类型：CD45RA-CCR7-效应记忆T细胞、CD45RA-CCR7+中央记忆T细胞、CD45RA+CCR7-终末分化T细胞和CD45RA+CCR7+纯真T细胞。效应记忆T细胞比终末分化T细胞处于更高分化阶段，在受到抗原刺激后，可以立即产生免疫效应，快速释放细胞因子并启动效应功能[11-12]。LTBI人群、治愈的肺结核和活动性肺结核患者的IFN-γ+CD4+T细胞主要为效应记忆T细胞(CD45RA-CCR7-)，但LTBI人群和治愈的肺结核患者终末分化T细胞(CD45RA+CCR7-)数多于活动性肺结核患者，这表明效应记忆T细胞可能为肺结核患者提供保护作用；
在IFN-γ+CD8+T细胞中，活动性肺结核患者也主要由CD45RA-CCR7-组成，而LTBI人群主要为CD45RA+CCR7-细胞[10]，终末分化T细胞与疾病的严重程度呈负相关，具有肺归巢和细胞毒性潜力，表明它具有抗结核作用。CD4+T细胞表面的人类白细胞DR抗原(human leukocyle antigen，HLA-DR)和CD38等标志物可反映T细胞的活化状态。菌阳肺结核患者经过8周治疗后，痰菌阴转患者的外周血中HLA-DR+和CD38+细胞在结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)特异性CD4+T细胞的比例明显下降，可能可以作为判断患者治疗有效性的指标[13]。活动性结核病患者外周血MTB特异性CD4+IFN-γ+T细胞上活化标志物HLA-DR和CD38，以及增殖标志物增殖细胞核抗原(nuclear associated antigen Ki-67，Ki-67)的表达较LTBI人群升高[14-15]。活动性结核病患者外周血T细胞上活化标志物HLA-DR的表达和Treg的比例较LTBI 和健康人群升高[16]。耐多药肺结核患者外周血T细胞上活化标志物HLA-DR的表达较普通肺结核患者下降[17]。结核病患者CD4+T细胞和CD8+T细胞上CD28的表达较健康对照组下降[18]。这说明结核病患者处于一种免疫异常活化状态。
CD27是一种跨膜糖蛋白，也是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，主要表达于淋巴细胞(包括各种类型T细胞、B细胞和NK细胞)。CD27通常作为T细胞激活和炎症反应的标志物，随着T细胞从幼稚或记忆过渡到效应细胞，其表达逐渐丧失。因此，CD27在中央记忆T细胞上表达，在效应记忆T细胞上也有不同程度的表达，而在终端效应记忆T细胞上不表达。CD4+T细胞在控制MTB感染方面发挥重要作用，而CD4+CD27-T细胞主要是终端效应记忆细胞、效应记忆细胞和效应细胞，它们发挥最快和最强的激活效应反应[19]。然而，该亚群也最有可能因为活化而诱导细胞死亡，并会因为体内抗原持续的刺激而耗竭，其频率降低。免疫系统的激活和炎症反应在结核病的免疫发病机制中起着关键作用。活动性结核病患者T细胞的总体免疫反应性普遍降低，治疗后恢复。活动性结核病患者外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞和NK细胞的IFN-γ分泌能力均较LTBI和健康对照组明显下降[20]，说明结核病患者的T细胞和NK细胞的功能下降。结核病患者治疗2个月后，外周血CD4+CD27-T细胞亚群上活化标志物IFN-γ、TNF-α、CD38和Ki67水平的表达较治疗前明显下降，可能是由于细菌负荷减少所致；
而CD4+CD27+T细胞亚群上活化标志物HLA-DR表达较治疗前明显升高，可能是Treg减少引起的。此外，早期分泌抗原靶6-培养滤液蛋白10(ESAT6-CFP10)刺激后细胞因子反应较治疗前明显减少，但豆蔻酰佛波醇乙酯刺激后细胞因子反应较治疗前明显增加。与PPD刺激的快速应答者相比，慢应答者产生IFN-γ的CD8+CD27-T细胞明显更多。若治疗前CD8+CD27-T细胞高水平表达IFN-γ，治疗2个月时通常预示培养阳性的风险较高。CD4+和CD8+T细胞表达的活化标记物(如PPD刺激的CD8+CD27-IFN-γ+和CD4+CD27+HLA-DR+CD38+T细胞)具有监测结核病治疗反应的潜在用途[19]。结核病患者CD14lowCD16+单核细胞比例较健康对照组明显下降；
与单侧感染组相比，双侧感染组患者的CD19+CD5+B细胞的频率和CD14lowCD16+单核细胞上HLA-DR表达强度均明显下降[21]。活动性结核病患者外周血中CD4+CXCR5+T细胞的比例较健康对照组明显下降，其活化标记物(HLA-DR和可诱导共刺激分子)和抑制受体[T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3， Tim-3)和程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)]的表达明显增加，而且结核特异性抗原诱导的抑制受体表达水平明显高于植物血凝素，但并不诱导该细胞显著表达IL-21和Ki-67；
阻断抑制性受体Tim-3和PD-1不仅可增加CD4+CXCR5+T细胞的频率，而且还可以恢复其增殖和细胞因子的分泌潜力[22]。B细胞依靠终末分化细胞——浆细胞分泌抗体发挥体液免疫应答效应。通过IgD和CD27的表达分为双阴记忆B细胞(CD19+IgD-CD27-)、静息B细胞(CD19+IgD+CD27-)、类型转换记忆B细胞(CD19+IgD-CD27+)和非类型转换的记忆B细胞(CD19+IgD+CD27+)[7]。在结核性胸膜炎患者的胸腔积液中双阴记忆B细胞较外周血中减少，而类型转换记忆B细胞增多。这说明在感染局部MTB的感染造成循环B细胞的重新分布[20]。
以上这些发现，均是一些小样本、单中心的临床观察，缺乏循证医学证据，需要进一步扩大研究样本量，纳入更多不同类型的结核病患者，统一检测方法，开展多中心临床研究，为结核病患者的免疫功能评价提供更多手段和临床依据，为研究其背后的免疫机制发挥价值。目前检测结核病患者免疫功能的技术包括库尔特计数(血常规)、流式细胞术(淋巴细胞亚群检测)、酶联免疫吸附试验或酶联免疫斑点试验或液相悬浮芯片检测技术(细胞因子检测)、胶体金技术或化学发光法(结核抗体检测)。近些年来，如流式细胞术(从传统的流式细胞术到全光谱流式细胞术、成像流式细胞术)等技术的发展，为临床评估结核病患者的免疫功能提供了技术支撑，可以减少临床的等待时间，用更少的样本量提供更多的检测结果。
在许多活动性结核病患者存在免疫细胞减少和免疫功能低下的情况下[23]，《共识》推荐在条件允许的情况下，对所有活动性结核病患者进行免疫功能状态评估。《共识》重点强调了对高龄、病变广泛、病情严重，合并HIV感染、糖尿病、贫血或低蛋白血症、免疫缺陷性疾病、免疫抑制剂使用和恶性肿瘤的活动性结核病患者重点进行免疫功能评价。
要正确把握免疫功能状态评估策略。首先，根据患者就诊时的血常规和结核感染检测(如PPD皮肤试验、γ-干扰素释放试验、Th1型细胞因子检测)结果进行初步的判断，如果反映免疫功能低下，则建议在有条件的临床实验室，进行淋巴细胞亚群检测，了解T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、B细胞的比例及数量。如果免疫细胞数量减少，则说明患者的免疫功能低下，若免疫细胞数量并没有减少，则建议进一步进行免疫细胞表型检测和免疫细胞功能检测，进一步了解患者的免疫状况，为进行免疫干预提供依据。鉴于机体免疫状态并不处于稳定不变的状态，随着治疗和疾病的进展会走向恢复或加重，并且每例患者的基础状态并不相同。因此，建议在首次就诊时即进行免疫功能评价，获得患者的基础免疫数据。然后根据患者疾病状态定期复查和动态监测，为进行免疫干预的时机选择和免疫调节剂的使用提供依据。例如，IFN-γ或IL-2 检测阴性的活动性结核病患者，若化疗联合雾化重组人γ-干扰素(rhuIFN-γ)或注射重组人白细胞介素-2(rhuIL-2)的治疗效果较单纯化疗效果好[24-26]。
目前主要用于结核病患者免疫功能评估的方法大多是基于血液的检测方法，其采样方便，对患者损伤较小，患者依从性较好，但其只能检测到外周血中的免疫改变。在结核感染的过程中，会有免疫细胞被趋化至感染部位发挥作用，其感染局部的免疫功能改变通过外周血检测是不够的，可通过检测患者肺泡灌洗液、胸腔积液等来实现。检测这些体液需要进一步临床研究来达成共识，也需要克服检测过程中的生物安全问题。
总之，《共识》介绍了我国现有的结核病免疫检测方法，提出了活动性结核病患者免疫功能状态评估的指征、方法及策略，指导临床医师的临床应用。随着新研发的免疫功能评价方法的深入研究和应用，将会更清楚、准确地描绘不同类型活动性结核病患者在不同阶段的临床免疫表征，为免疫干预的时机把握和免疫调节剂的合理选择提供更充分的依据。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献薛勇：起草文章；
吴雪琼：对文章的知识性内容作批评性审阅、指导文章撰写
