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李慧倩 胡 英 许玉珍 李积东 郭玉静 永 胜 （青海大学医学院， 西宁 810016）
高海拔地区稀薄的氧气环境对高原居民和进驻者的身心健康产生很大影响。海拔上升3 000 m以上的高原地区后，大气中的氧分压会随着海拔的升高急剧下降，进而造成人体组织细胞缺氧，严重影响机体的新陈代谢和正常生理功能。由于海拔高度的变化引发的持续性低氧刺激会导致急进 高原人群出现高原肺水肿（high altitude pulmonary edema，HAPE）和高原脑水肿（high altitude cerebral edema，HACE）等急性高原反应，也会加剧高原常驻人群罹患多囊血症和各种慢性心血管疾病的风险［1-2］。因此，机体在高原低氧暴露下的变化状况以及各组织系统响应低氧胁迫的分子机制成为近年来高原医学研究备受关注的课题。众所周知，免疫系统是机体重要的防御系统，对于维持组织稳态平衡和机体各项功能的正常运作有着不可替代的作用。研究发现，低氧可以通过低氧诱导因子（hypoxia inducible factors，HIFs）驱动的转录调控调节免疫细胞的增殖、发育和效应因子功能［3-4］。有报道称，缺氧可增加大鼠各器官的免疫细胞浸润和炎症反应，进而参与急性高原疾病的发生、发展［5-6］。此外，也有研究显示高原低氧暴露可导致免疫系统功能异常，从而加剧HAPE、HACE等急性高原反应［7-8］。由此可见，高原低氧环境对机体免疫系统的相关影响亟待引起广泛重视。
随着新一代测序技术的出现以及各种生物信息学工具的发展，基于RNA测序（RNA-sequencing， RNA-seq）的转录组分析技术日趋成熟。RNA-seq为基因组研究、免疫和发育基因鉴定以及数字基因表达分析奠定了坚实的基础，成为组学范围内分析差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）和阐明各种复杂性疾病潜在机制的不可或缺的工具［9］。目前，RNA-Seq技术已广泛应用在机体各个组织系统响应低氧胁迫的研究中，揭示了一系列适应低氧胁迫的分子变化。如XU等［10］发现低压低氧暴露的大鼠肝脏模型中细胞因子-细胞因子受体相互作用和半乳糖代谢等免疫相关代谢途径在KEGG通路分析中得到了高度富集，提供了大鼠对应激环境做出反应的重要生理线索。在高原低氧暴露的大鼠肺组织中发现介导炎症反应的NOD样受体信号通路显著上调，结合进一步的炎症因子检测结果提示高原低氧暴露可能激活肺组织中的NF-κBp65和p38MAPK信号通路以促进下游炎症因子的转录，从而加重肺组织重塑的发生和发展［11］。以上研究为揭示大鼠适应高原低氧暴露的分子机制提供了新的思路。此外，高海拔牦牛与低海拔黄牛在心、肾、肝和肺4个主要器官的比较转录组分析结果提示牦牛在长期的进化过程中优化了其抗低氧代谢系统以适应高海拔环境［12］。有报道称，对来自不同海拔高度的山羊群体进行心、肺和骨骼肌组织的转录组测序后，发现大量DEGs和单核苷酸变体基因在低氧相关的功能基因类别中过度表达，且不同海拔山羊群体的心、肺和骨骼肌等不同组织中DEGs普遍在核糖体和蛋白质合成等生物类别富集，提示核糖体和蛋白质生物合成过程的变化可能是山羊低氧习服的重要机制［13］；
以上结果为探索哺乳动物高原习服的复杂基因表达及其相关调控机制提供了研究基础。然而，利用RNA-Seq技术探究免疫组织响应低氧应激调控机制的报道仍然有限。
脾脏作为哺乳动物最大的外周免疫器官，它不仅是免疫细胞（包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞）定居与发生免疫应答的部位、也是淋巴系统参与再循环与抗原识别的部位［14］，是机体免疫系统不可或缺的组成部分。因此，本次实验选取小鼠的脾脏组织作为研究对象，通过转录组测序分析，比较其在不同海拔暴露下的差异表达转录本，以筛选低氧胁迫适应DEGs，并重点关注免疫相关DEGs集在高原低氧暴露下的变化，探究机体免疫系统响应低氧应激的分子机制，为相关高原病的病因学研究提供新的理论依据。
1.1 材料
1.1.1 实验动物 6～8周龄的SPF级C57BL/6健康雄性小鼠（许可证号：SYXK（陕）2020-005）购自西安交通大学医学部实验动物中心，保持环境卫生，采用自由采食饮水方式饲养。待小鼠适应周围环境后，随机分成两组，5只/组。对照组即平原常氧组（PSC）：饲养于西安交通大学医学部实验动物中心（海拔400 m）；
②实验组即高原低氧组（HST）：饲养于青海省果洛藏族自治州玛多县人民医院实验动物房（海拔4 200 m）。两组小鼠均在温度为18～22 ℃，湿度为45%～55%的受控环境中分笼常规喂养，期间自由饮水、进食。30 d后无菌采集小鼠脾脏，一部分置于10%中性甲醛溶液中固定保存，另一部分置于液氮冻存备用。
1.1.2 主要试剂 Trizol裂解液（美国Invitrogen公司）；
逆转录试剂盒（PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser）（RR047A），qPCR试剂盒（TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（RR820A，TaKaRa，日本）；
Illumina测序（北京诺禾致源有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取、cDNA文库构建以及Illumina测序 采用常规Trizol法提取各组小鼠脾脏总RNA，DNase I（RNase-free）消化残余DNA。通过安捷伦2100生物分析仪检测RNA完整性和质量。经富集、打断、合成cDNA、末端修复、PCR扩增等过程制备测序文库进行Illumina测序。
1.2.2 RNA-Seq质量评估和序列比对 对测序平台得到的原始数据（Raw Reads）进行质量控制及过滤。对Clean Data进行Q20、Q30和GC含量计算，同时选择错误率＜1%的数据用于后续转录组分析，更严格过滤得到High Quality Clean Reads。选用HISAT2软件将Clean Reads与参考基因组进行快速精确的比对，样本之间（包括5个生物学重复）的基因表达水平采用皮尔逊相关性检测进行分析。
1.2.3 DEGs分析 采用Subread软件中的Feature Counts工具对每个样本分别进行基因表达水平的定量分析，并利用FPKM（Fragments Per Kilobase per Million）先后对测序深度和基因长度进行了校正。
使用DESeq2软件（1.20.0）进行PSC组和HST组之间的DEGs分析，使用Benjamini & Hochberg 的方法校正P值。将校正后的P值（P-adjust）＜0.05且|log2FoldChange|＞0作为显著差异表达的阈值。
1.2.4 GO注释和KEGG分析 Gene Ontology（简称GO，http://www.geneontology.org/）即基因本体数据库，包括分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）和细胞组成（cellular component，CC）3个部分。富集分析采用软件为clusterProfiler （3.4.4），找出DEGs显著富集的GO条目并计算P-value。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.kegg.jp/）是系统分析基因功能、基因组信息的数据库。采用Blast GO软件分析得到DEGs通路注释信息，同时使用R软件对注释结果进行通路显著性富集分析并计算P-value，P＜0.05视为显著富集。
1.2.5 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） 常规基于超几何分布的富集分析依赖于显著上调或下调的基因，容易遗漏部分差异表达不显著但有重要生物学意义的基因。GSEA不需要指定明确的DEGs阈值，从基因集富集分析的角度出发，更容易囊括细微但协调性的变化对生物通路的影响。本研究通过Broad Institute提供的GSEA工具对KEGG数据集进行GSEA（http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp），并 以NominalP-value＜0.05为阈值对结果进行筛选，对此前的功能富集分析结果做出补充。
1.2.6 RT-qPCR验证与检测 随机选择15个表达模式不同的上下调DEGs验证转录组测序结果的准确性。以β-actin作为内参，进行RT-qPCR验证。采用2-ΔΔCt法测定实验组基因表达相对于对照组的倍数变化，引物序列详见表1。RT-qPCR反应体系为20 μl，各试剂反应量为：TB Green®Premix Ex TaqTMII 10 μl，RNase Free H2O 6.4 μl，cDNA 2 μl，PCR正反向引物各0.8 μl。反应进行条件为：95 ℃ 30 s；
95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s；
40个循环。通过SPSS18.0统计软件对结果进行分析，采用独立样本t检验，结果以±s表示。P＜0.05表示差异有统计学意义。
表1 RT-qPCR引物信息Tab.1 Primers information of genes for RT-qPCR
2.1 测序数据处理与质量评估 通过双端测序法分别对PSC组和HST组的5个重复样本进行测序，构建转录组文库，并对原始数据进行质量控制，获得 了41.47 M（PSC）和40.68 M（HST）的Clean Reads。测序所得数据碱基错误率均为0.02%，且各个样本Q20均＞98.10%、Q30均＞94.64%，GC含量在48.30%～50.36%之间。这表明本次转录组测序数据质量较高、结果可靠，可用于后续分析（表2）。
表2 过滤后的数据统计Tab.2 Statistics of filtered data
2.2 DEGs分析 在进行4周的高原低氧处理后，比较PSC和HST的基因表达情况。共鉴定出4 218个DEGs，其中1 950个基因表达上调，2 268个基因表达下调（|log2FC|≥0和P-adjust＜0.05）（图1）。随后对各组样品进行了皮尔逊相关性分析，结果显示样本间基因表达量的相关系数R2均＞0.953，表明样品表达模式的相似程度较高，实验数据可靠。为了研究高原低氧和平原常氧处理的脾脏转录组数据之间的样本异质性，对所得DEGs进行了层次聚类分析。结果表明（图2），生物学重复样品之间基因表达情况较为一致（纵坐标），不同海拔高度下小鼠脾脏组织对低氧的反应较为不同（横坐标）。
图1 DEGs火山图Fig.1 Volcano plot of DEGs
图2 DEGs热图Fig.2 DEGs heat map
2.3 DEGs的GO注释分析 为了解DEGs在低氧胁迫反应中的生物学功能，对先前所得的差异基因集进行了GO注释分析。结果显示，DEGs主要分布在生物过程的B细胞激活、免疫应答-激活信号转导和免疫应答调节信号通路，细胞组分的免疫球蛋白复合体和免疫球蛋白复合体循环，以及分子功能的抗原结合和免疫球蛋白受体结合等分类（图3A）。因此，GO富集分析结果提示高原低氧胁迫条件下，机体的免疫系统发生了重要变化。
图3 DEGs的GO注释分析和KEGG通路富集分析Fig.3 GO annotation analysis and KEGG pathway enrichment diagram of DEGs
2.4 DEGs的KEGG富集分析 为了确定与低氧胁迫适应相关的生物通路，并深入探讨免疫系统响应低氧应激的分子机制，将两组的免疫相关DEGs集映射到KEGG通路数据库中进行富集分析，共富集到178个信号通路（P＜0.05），其中显著富集的通路，如图3B。结果显示，DEGs在细胞因子-细胞因子受体相互作用、NOD样受体信号通路、趋化因子信号通路、JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路以及TNF信号通路等多个免疫炎症相关信号通路中高度富集，说明面对低氧胁迫，机体可能发生了免疫失衡和炎症反应。2.5 基于KEGG功能注释的GSEA GSEA结果显示（表3），HST组NOD样受体信号通路富集，且表达趋势上调，这与KEGG通路富集分析的结果一致，说明NOD样受体信号通路在低氧胁迫下发生了重要变化。
表3 DEGs的基因集富集分析Tab.3 Gene set enrichment analysis of DEGs
2.6 RT-qPCR验证结果 RT-qPCR实验结果显示（图4），15个随机选择的基因在HST组与PSC组之间均有显著差异，且基因变化趋势与RNA-seq的结果完全一致，进一步证实了本次测序结果的可靠性。
图4 RT-qPCR验证结果Fig.4 RT-qPCR validation results
高原低氧胁迫影响机体免疫功能。本研究通过比较不同海拔暴露下的小鼠脾脏组织转录组谱，旨在找出与低氧胁迫适应相关的DEGs及其表达模式，深入了解低氧胁迫影响免疫系统转录调控的机制。
30 d的高原低氧暴露处理之后，与平原常氧处理相比，小鼠脾脏组织中多个基因发生了差异表达。其中差异最显著且表达量较高的基因主要包括ANXA1、S100A8、S100A9和HSPB1等。ANXA1是一种糖皮质激素调节的蛋白，具有强大的抗炎和促分解功能。研究发现，ANXA1缺失的小鼠在实验性狼疮性肾炎和结膜炎模型中表现出炎症反应加剧［15-16］；
YANG等［17］证明缺氧可通过稳定HIF-1α上调ANXA1的表达，而抑制HIF-1α会阻断缺氧诱导的ANXA1表达。低氧主要通过HIFs激活下游信号发挥各种调控功能，本研究中ANXA1基因的上调表达结合以上研究结果提示高原低氧胁迫激活了抗炎反应过程。另外两个表达显著上调的因子是S100A8和S100A9，它们均是S100家族中的炎症介质，主要存在于中性粒细胞与单核细胞等先天免疫细胞之中。S100A8/A9主要通过与模式识别受体Toll样受体4（TLR4）和晚期糖基化终产物受体（RAGE）等结合激活下游信号通路从而诱导炎症细胞向炎症部位迁移并释放大量炎症细胞因子，在炎症反应过程中发挥重要作用［18-19］。有报道称，S100A8/A9在创伤、感染、应激和许多其他炎症过程中都强烈上调［20］。比如缺氧应激条件下骨髓细胞中的HIF-1转录活化，并通过刺激VEGF和S100A8表达促进血管生成［21］；
持续的缺氧缺血可显著增加急性心梗患者外周血中的S100A8/A9表达水平，从而加速炎症反应进程和细胞外基质降解更易触发心脏破裂［18］。因此，本研究结果提示，高原地区持续的低氧刺激诱发体内S100A8、S100A9因子过表达可能会进一步触发体内的炎症反应。HSPB1又称HSP27，是热休克蛋白家族中的一种多功能蛋白质。多项研究表明，HSP27可以通过不同的方式发挥细胞保护作用。比如，ZHANG等［22］与TIAN等［23］发现HSP27可以降低氧化应激介导的细胞内活性氧和基质金属蛋白酶的生成，从而抑制细胞色素c或其他促凋亡因子的释放，发挥抗凋亡作用；
TATSUKI等［24］发现在大鼠急性肾损伤中，HSP27的表达上调增加自噬通量，抑制H2O2诱导的细胞凋亡。此外，也有报道显示，HSP27具有调节谷胱甘肽水平、稳定细胞骨架和抗氧化损伤等生物功能［25］。机体细胞的自噬、凋亡及抗氧化作用是维持细胞内稳态的重要保障，本研究中，高原低氧实验组基因HSP27的表达显著低于平原常氧对照组，提示长期的低氧暴露可能导致机体的内环境稳态发生紊乱。
通过对DEGs集进行GO注释分析发现，三大功能分类中占比最高的GO条目均与免疫调节有关，这提示高原低氧胁迫导致机体的免疫系统发生重要变化。随后对免疫相关基因集进行了KEGG通路富集分析，发现包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路、NOD样受体信号通路等多个通路发生了显著变化。JAK-STAT信号通路是多数细胞因子发挥效应功能的重要通路。据报道，JAK-STAT信号通路参与机体造血、免疫平衡、炎症反应以及细胞生长、凋亡等生物事件的发生［26-27］。研究发现，通过对大鼠肺微血管内皮细胞（LMVEC）进行低氧处理，LMVEC上清中IL-6的分泌、JAK激酶与STAT的磷酸化均显著增强，提示低氧激活了LMVEC中IL-6介导的JAK/STAT炎症通路，参与肺内皮损伤［28］。高原低氧组小鼠脾脏JAK-STAT信号通路中IL-7与IL-7R基因显著上调。IL-7主要通过其受体IL-7R发挥作用，二者的有效结合是T、B淋巴细胞正常发育过程中必不可少的环节。然而， IL-7/IL-7R信号轴的过度激活会导致免疫平衡的失调。比如，研究发现炎症性肠病患者的结肠黏膜中，IL-7和IL-7R表达显著增高［29］；
IL-7过表达转基因小鼠肠道模型中，肠黏膜上皮内淋巴细胞和固有层淋巴细胞表型和功能受到显著影响［30］。结合以上研究结果推测，高原低氧暴露下IL-7及IL-7R表达显著增强可能致使机体免疫调节失衡。
为了进一步对基因表达量的整体变化趋势做出解释，本研究进行了基因集富集分析。结果发现上调的DEGs显著富集于NOD样受体信号通路，这与KEGG通路富集结果一致，强调了NOD样受体信号通路的生物学功能。NOD样受体蛋白家族是 一组模式识别受体（PRR），可以介导损伤与应激等先天免疫反应。当机体内环境受到外部刺激发生改变时，病原体相关分子模式或损失相关分子模式激活NOD样受体进而启动下游信号通路，使基因表达发生深刻变化，最终导致广泛的宿主防御和炎症因子的产生（如IL-1β、TNF和IL-6等）。例如，研究报道，NOD样受体信号通路在高原低氧暴露期间介导炎症性肺损伤［11］；
慢性间歇性缺氧诱发的内皮损伤与NOD样受体信号通路有关［31］。NLRP1B是炎症体NLRP1家族成员。与NLRP1B功能相关的多数研究都集中在炎症调节方面，炎症体信号的失调可能导致高度炎症状态，最终导致自体炎症障碍、神经退行性疾病和癌症进展［32-35］。本研究中高原低氧处理条件下NLRP1B的表达高度上调提示低氧处理可能激活了NOD样受体信号通路的炎症体信号，进而导致促炎反应的发生。
本研究通过对高低海拔暴露下小鼠的脾脏组织进行高通量转录测序分析，检测到大量参与低氧胁迫适应的DEGs，且GO注释分析显示这些DEGs大多集中在免疫相关的功能模块。KEGG通路富集结果发现，多个免疫炎症相关的信号通路显著富集。本研究结果结合上述研究报道表明，免疫调节参与机体对高原低氧胁迫的适应机制；
同时，高原低氧暴露环境下，免疫系统响应低氧胁迫的转录调控分子（如IL-7、IL-7R及NLRP1B）可能致使机体内部免疫调节和炎症反应失衡，这与JAK-STAT及NOD样受体信号通路有关。总之，本研究丰富了高原医学在医学免疫学领域的研究内容，为深入探讨机体免疫系统响应高原低氧胁迫的分子调控机制提供了线索，也为相关高原病的病因学研究提供了新的理论依据和研究方向。
