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徐明鹏 韦虹羽 李颖华 梁象东 方 妮 陈 艳
（广西医科大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，南宁 530007）
马尔尼菲篮状菌病（曾称马尔尼菲青霉菌病）主要分布于中国南部（含香港、台湾）和东南亚地区［1］。马尔尼菲篮状菌（Talaromyces marneffei，TM）是流行区域常见机会致病性真菌，可导致全身播散性侵袭性感染。近年免疫缺陷或免疫功能低下或使用免疫抑制剂患者增多，使得马尔尼菲篮状菌病发生率急剧上升。文献报道，每年新发TM感染患者约50 000例［2］。HIV患者中，TM感染率高达16.1%，TM感染是HIV最常见并发症之一，病死率显著高于其他并发症［3］。近年非HIV患者TM感染率亦逐年增多，已成为中国南部常见真菌感染性疾病［4］。如不及时诊治，病死率几乎高达100%，即使及时给予抗真菌药物治疗，病死率仍高达30%［5］。WU等［6］报道，播散性马尔尼菲篮状菌病即使给予足量足疗程抗真菌治疗，复发率仍高达50%。由于抗真菌药物难以彻底清除TM，病死率及复发率较高，临床治疗难度大，故阐明TM的致病机制，探索新的治疗手段迫在眉睫。
lncRNA是近年研究热点，但其在感染性疾病过程中的调节作用研究甚少，主要集中于细菌及病毒致病机制研究，在致病性真菌方面鲜有报道。本课题组率先开展了宿主lncRNA在病原真菌感染过程中调节基因表达的研究，TM感染宿主后，引起宿主lncRNA适应性改变，一方面导致宿主患病，另一方面起免疫防御作用。本课题组前期通过基因芯片检测了TM感染BEAS-2B细胞株4 h后lncRNA和mRNA的表达谱，共检测到848个lncRNA及mRNA具有显著差异表达，其中lncRNA-NR_046269表达较对照组显著升高［（37.23±2.04）倍，P＜0.05］［7］。本研究通过构建编码/非编码基因共表达网络，发现NR_046269与IL-6表达呈显著负相关，并通过RNA过表达/敲低技术证实NR_046269可调节IL-6表达，拟从lncRNA基因表达调控角度探讨TM感染早期免疫应答的分子机制，为临床寻找治疗靶点提供 新的依据。
1.1 材料 人支气管上皮细胞株BEAS-2B及TM标准菌株均保存于广西医科大学实验中心；
10%胎牛血清、RPMI1640培养基、逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒均购自Life Technologies公司；
ELISA试剂盒购自CUSABIO公司；
敲低及过表达慢病毒载体均购自上海吉玛公司，干扰片段序列为5"-GGCGACAAGCAACAACAATCA-3"。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养BEAS-2B细胞株，37 ℃、5%CO2培养，按1∶2隔天传代1次。
1.2.2 菌悬液制备与分组 将TM菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，置于真菌培养箱25 ℃培养，7～10 d后用无菌PBS溶液反复刮洗TM培养基上的菌落，无菌纱布过滤、离心，得到TM孢子。RPMI1640培养基重悬TM孢子，调整孢子悬液至适当浓度。实验组以感染复数为10∶1的TM孢子加入BEAS-2B细胞培养4 h，对照组细胞采用等量RPMI1640培养基处理。
1.2.3 编码/非编码基因共表达网络构建 根据前期基因芯片检测结果，通过R语言统计环境计算 lncRNA NR_046269与差异mRNA的皮尔森相关系数（Pearson correlation coefficient，PCC），筛选阈值为|PCC|≥0.97且P＜0.05。采用Cytoscape（v2.8.1）构建编码/非编码基因共表达网络。
1.2.4 qPCR 采用TRIzol法提取细胞总RNA，转录成cDNA。按照qPCR试剂盒说明书，在EP管中加入反应体系。qPCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性3 s，60 ℃延伸30 s，40个循环。内参GAPDH 及目的基因引物均由Life Technologies公司设计合成（表1）。2-ΔΔCt法计算lncRNA和mRNA相对表达。
表1 qPCR引物序列Tab.1 Sequences of primers used for qPCR
1.2.5 ELISA 收集实验组及对照组细胞上清，参照ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪检测两组细胞450 nm处光密度（OD）值，计算样本浓度。
1.2.6 细胞转染 对数生长期BEAS-2B细胞株中加入构建好的慢病毒载体进行细胞转染，转染12 h后弃含病毒液的培养基，加入含血清的细胞培养基，倒置荧光显微镜下观察细胞状态及荧光强度。转染48 h后传代，待细胞贴壁后加入嘌呤霉素，筛选克隆阳性细胞系。
1.3 统计学处理 采用SPSS20.0软件进行统计学分析，结果以±s表示。组间比较采用双侧t检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 lncRNA-NR_046269与IL-6表达呈负相关 通过构建编码/非编码基因网络筛选出NR_046269与154个mRNA显著相关（|PCC|≥0.97，P＜0.05），其中116个mRNA与NR_046269呈正相关，38个mRNA与NR_046269呈负相关（图1）。NR_046269与IL-6呈显著负相关（PCC=-0.998，P＜0.05）。qPCR结果显示，与对照组相比，实验组IL-6 mRNA表达降低（0.82±0.21）倍（P＜0.05，图2A）。ELISA结果亦显示实验组IL-6表达较对照组显著降低［（0.42±0.25） ng/mlvs（0.81±0.26） ng/ml，P＜0.05，图2B］。
图1 NR_046269与差异表达mRNAs相关性分析Fig.1 Correlation analysis between NR_046269 and differentially expressed mRNAs
图2 TM感染BEAS-2B细胞4 h后IL-6表达Fig.2 Expression of IL-6 in BEAS-2B cells after infection with TM for 4 h
2.2 NR_046269负调控IL-6表达 为验证NR_046269对IL-6表达是否有负调控作用，对NR_046269进行敲低和过表达，qPCR检测NR_046269敲低组和过表达组IL-6 mRNA表达。qPCR结果显示，敲低组NR_046269表达显著下调，而IL-6表达显著上调（P＜0.05）。相反，过表达组NR_046269表达显著上调，而IL-6表达显著下调（P＜0.05，图3）。提示lncRNA-NR_046269对IL-6具有负调控作用。
图3 qPCR检测NR_046269过表达和敲低组IL-6表达Fig.3 qPCR was performed to verify expression of IL-6 in overexpression or knockdown of NR_046269 groups
感染发生、发展和转归是病原微生物与宿主相互作用的结果，机体免疫应答和微生物免疫逃避决定疾病转归。TM分生孢子随呼吸到达下呼吸道，黏附并穿透支气管上皮细胞，随后被单核/巨噬细胞吞噬，并潜伏于网状内皮系统，通过网状内皮系统播散到全身各组织器官［8］。TM潜伏于网状内皮系统，逃避机体免疫杀伤作用。支气管上皮细胞作为固有免疫系统重要组成，在防御病原体入侵及诱导后续免疫应答和免疫逃避过程中起关键作用［9］。因此，及时启动和完全激活支气管上皮细胞固有免疫应答对宿主清除病原体至关重要。
IL-6是经典的急性期反应和淋巴细胞刺激因子激活剂，是搭建固有免疫应答和适应性免疫应答的关键桥梁分子［10］。SCHAPER等［11］研究表明，IL-6通过与可溶性IL-6受体gp130蛋白结合诱导巨噬细胞向M1型分化，分泌大量促炎因子，介导Th1型免疫应答，从而杀伤及清除病原体。多数病原体感染急性期，如SARS-CoV-2病毒感染后，IL-6表达显著升高，并与病毒载量呈正相关［12］。但少部分病原体感染急性期，IL-6表达无明显升高。如结核分枝杆菌感染脂肪细胞时分泌较低水平的IL-6，有助于结核分枝杆菌潜伏于脂肪细胞内［13］；
沙眼衣原体感染宫颈上皮细胞后120 h内促炎因子和趋化因子IL-6、TNF-α和CXCL8表达无显著差异，表明沙眼衣原体可逃避强有力的促炎因子和趋化因子应答，有利于沙眼衣原体适应细胞内微环境［14］。本研究中，TM感染人支气管上皮细胞4 h后，qPCR及ELISA结果均显示IL-6表达显著降低，提示IL-6可能是TM诱导免疫逃避的重要炎症因子之一。
lncRNA是基因调控网络主要参与者，其精确序列和自然结构决定其与谁互动和发挥何种作用［15］。lncRNA可通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-蛋白相互作用调节基因转录、剪接、核酸降解和翻译等［16］。虽然多数lncRNA的功能尚不清楚，但越来越多的研究表明，lncRNA在固有免疫应答中可广泛调节基因表达，是极其重要的固有免疫调节因子［17］。TM感染BEAS-2B细胞后lncRNA-NR_046269显著差异表达。本研究通过生物信息学分析发现， NR_046269与IL-6表达呈显著负相关。为了解 NR_046269与IL-6在BEAS-2B细胞中的互作关系，采用慢病毒载体转染BEAS-2B细胞株，敲低及过表达NR_046269，qPCR结果显示，NR_046269敲低组IL-6表达显著上调，而NR_046269过表达组IL-6表达显著下调。由此推断TM感染BEAS-2B细胞后 lncRNA-NR_046269具有反向调节IL-6表达的作用。
综上，本研究明确了TM感染早期lncRNA-NR_046269对IL-6的负调节作用，为阐明TM致病机制及临床防治TM感染提供了新的依据。
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