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孟洁琼，刘寒玉，王振红，赵雅梅，魏海燕，史宏伟
通过超声二维斑点追踪显像技术（two-dimensional speckle-tracking imaging，2D-STI）评估2D应变可提供整体和局部心室功能的定量信息。有研究者使用复苏离体猪心对超声应变成像进行验证，证明在量化心肌整体和局部变形模式上2D-STI是一种可控、可重复的实用技术[1]。先前国外研究者使用慢性心肌梗死猪模型来研究局部心肌应变，通过评估纵向和环向应变率及生物化学指标证明梗死节段纵向和环向应变力明显低于非梗死节段，但是由于猪心脏结构及胸部解剖的差异使用经胸超声具有一定局限性，在各参数生理范围不明确和样本量较小的前提下，评估实验组的数据存在一定误差[2]。因此笔者在基于2D-STI技术，使用Qlab软件定量分析健康猪模型心肌应变力和心室内同步化运动，研究各参数正常值范围，讨论动物模型行经食管超声心动图（transesophageal echocardiography，TEE）监测时麻醉方法和切面获得的可信区间（confidence interval，CI），为2D-STI在动物实验中的应用提供合理参数和对比资料。
1.1 实验材料
选择10头健康的实验用家猪，猪龄12～18个月，平均猪龄14.7个月；
体质量45～60 kg，平均体质量50.7 kg。均由南京医科大学附属南京医院动物实验中心提供，动物使用许可证号SYXK（苏）2021-0006，饲养级别为普通环境、普通级。所有实验均根据《国家实验动物管理条例》在南京医科大学附属南京医院动物实验中心实验室进行，动物伦理审批号DWSY-19015127。
1.2 方法
1.2.1 麻醉方法
1.2.1.1 麻醉诱导 实验前，实验猪至少禁食禁饮8 h。所有猪均需进行基础麻醉，自由活动1 h后，给予肌内注射咪达唑仑（0.5 mg/kg）和氯胺酮（10 mg/kg）充分镇静，并根据其镇静深度适当追加麻醉药物。基础麻醉后将猪仰卧位放在实验手术台，靠偏右侧仰卧位将其四肢固定，以便获得最佳的猪模型心脏超声图像。在耳缘静脉处建立静脉通路（静脉导管型号为22 G或20 G），随后进行全身麻醉诱导，单次静脉推注丙泊酚（0.5～1.0 mg/kg）和瑞芬太尼（1～2μg/kg），咽喉部利多卡因表面麻醉辅助，当姿势反射和睫毛反射消失后，采用直喉镜暴露声门进行气管插管（型号6.0 F，用于45～60 kg的猪）。注意在诱导期间保留自主呼吸。插管后机械通气模式为间歇正压通气（intermittent positive pressure ventilation，IPPV）， 吸 氧 浓 度（fraction of inspiration O2，FiO2）100 %，潮气量（tidal volume，Vt）6～8 mL/kg，呼吸频率 （respiratory rate，RR）15次/分，吸呼比（I∶E）1∶2，呼气末二氧化碳分压（partial pressure of end-tidal carbon dioxide，PetCO2）维持在35～45 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。
1.2.1.2 麻醉维持 全身麻醉维持采用静吸复合的方法，在100 %氧浓度下加用1 %七氟醚吸入（氧流量为2 L/min）和丙泊酚[2 mg/（kg·h）]、瑞芬太尼[0.1μg/（kg·min）]静脉连续输注。在实验过程中，通过静脉滴注羟乙基淀粉注射液和林格氏注射液以满足生理需求。全程监测基本血流动力学，连续监测三导联心电图，通过皮肤脉搏氧饱和度探头监测SpO2，并且穿刺右侧股动脉进行有创动脉压力监测。
1.2.2 经食管超声心动图监测方法
采用荷兰Philips CX-50超声系统和X7-2T探头（Philips Healthcare，Andover，MA，USA），麻醉诱导后，确保探头处于中线位置且稍微向前弯曲，然后将TEE探头插入口咽并继续向前深入，必要时可借助喉镜指导探头插入。在口中合适位置放置牙垫，以保护超声探头不被损坏。将猪的三导联心电图连接在超声心动图主机上以获得连续的心电图信号。从食管中部开始，由经验丰富的心血管麻醉医生根据围术期TEE指南进行全面的TEE检查，1名麻醉医生负责动物猪的麻醉监测和管理，另1名麻醉医生负责记录数据和存储图像[3]。按照欧洲心血管影像协会（The European Association of Cardiovascular Imaging，EACVI）和美国超声心动图学会（The American Society of Echocardiography，ASE）在2014年发布的共识《二维斑点追踪超声心动图通用标准》，在所有图像获取和分析过程中均规范操作[4]。
1.2.3 图像获取
由于猪的心脏形态和位置与人不尽相同，超声探头放置的深度、旋转角度等都有所变化。操作探头使心内膜显示清晰后，记录2～3个心动周期，存图以备分析。采集图像时暂停机械通气，并记录实时心率（heart rate，HR）和平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）。此次获得所需的超声心动图二维图像四个切面，具体方法如下所述。
（1）食管中段四腔心切面（mid esophageal-four chamber，ME-4C）：这是最容易获得的图像，探头通过口咽部之后一边缓慢地向前推进探头，一边观察图像中出现的结构，整个过程维持角度在0°～15°。如果屏幕上显示出主动脉瓣则继续深入一点；
如果可见冠状窦或在近场区看不到左心房则需稍微退出探头。若图像显示不清，可以操作旋钮前屈探头以使其更贴近食管壁。需注意的是，禁止在探头前后屈曲时用力深入或者后退。
（2）食管中段两腔心切面（mid esophageal-two chamber，ME-2C）：在ME-4C维持探头深度不变，增加角度至35°～60°，适当右旋以显示出左心房和左心室。
（3）经食管中段三腔心切面（mid esophagealthree chamber，ME-3C），也称食管中段左心室长轴切面：自ME-2C稍微向前深入探头并增加角度至70°～100°，辅以向右旋转探头就可以显示出左心室、左心房及主动脉根部。
（4）经胸左心室中段乳头肌水平切面（transthoracic left ventricular mid-papillary，TTM）。由于猪的胃与心脏之间特殊解剖位置和结构与人体解剖位置不同，在进行TEE检查时对经胃短轴各切面（基底部、乳头肌中段、心尖部）追踪不到图像，因此改为体表经胸超声心动图（transthoracic echocardiography，TTE）监测。将经胸超声探头放置在猪胸骨左缘第三肋间，探头标志朝向左前腿方向，移动探头直至左心室短轴切面中乳头肌水平显像清晰。图1是1例编号为8动物猪（No.8）的TTM超声图像。
图1 TTM超声图像Fig.1 Ultrasound image of TTM
1.2.4 图像分析
使用荷兰飞利浦Qlab软件（9.1版本）的自动心肌运动量化 （automated cardiac motion quantitation，aCMQ）技术，定量分析心肌应变力和同步化运动的数值。使用斑点追踪程序进行处理，系统自动将左心室壁长轴切面分成17节段、短轴分成16节段，并对每节段的心肌进行斑点追踪分析。①根据对经食管中段三个切面（ME-4C、ME-2C、ME-3C）长轴的心肌纵向应变（longitudinal stain，LS）的各分析节段划分方法，获得17节段LS曲线，得到左心室三个切面的LS（LS-ME4、LS-ME2、LS-ME3），由于应变力自动计算为负值，其负值的绝对值越大代表应变力越强，因此结果中的数据采用绝对值来表达。通过求得平均值即为左心室整体纵向应变 （global longitudinal strain，GLS）。同时测量各节段收缩期LS达峰时间（即自ECG QRS起点至LS峰值的时间），并计算各节段达峰时间的标准差（peak longitudinal systolic time standard deviation for left ventilation，GL Time SD）。图2是8号动物猪ME-4C左心室心肌LS的分析方法与结果；
图3是ME-4C、ME-2C、ME-3C三个切面同步化指标分析的结果。②同理分析TTM的短轴中段乳头肌环向应变（short axis mid-papillary circumferential stain，MCS），同时分析得出左心室同一层面6个节段（人体一般短轴分成16节段，只采用中乳头肌水平切面为代表）环向应变收缩期达峰时间的标准差 （peak longitudinal systolic time standard deviation，GC Time SD），图4是TTM的MCS的分析过程和结果（No.8）。③依据以上步骤分析并记录ME-4C的右心室纵向应变（right ventricular longitudinal strain，LS-RV）与收缩期达峰时间的标准差（RV Time SD）。图5是ME-4C LS-RV的分析结果。追踪过程中要仔细调整感兴趣区域的范围，以保证获得满意的结果。
图2 左心室心肌LS-ME4平均值（-27%）Fig.2 Image of left ventricular myocardium LS-ME4 mean value(-27%)
图3 左心室长轴各节段达峰时间的标准差及平均值（GL Time SD=99 ms）Fig.3 Image of standard deviation and mean value of time to peak of left ventricular long axis(GL Time SD=99 ms)
图4 TTM的左心室心肌MCS（-23%）Fig.4 Image of left ventricular myocardial MCS mean value at TTM(-23%)
图5 ME-4C的右心室心肌LS-RV平均值（-29%）Fig.5 Image of right ventricular myocardium LS-RV mean value at ME-4C(-29%)
采用辛普森法计算LVEF，在ME-4C测量LVEF；
彩色室壁运动分析（color kinesis，CK）技术在ME-4C测量RVEF。应用频谱多普勒技术取左心室流出道（left ventricular outflow tract，LVOT）的血流频谱测量速度时间积分（velocity time integral，VTI），在ME-3C测量LVOT直径（D），计算LVOT的截面积（cross-sectional area，CSA）（CSA=π×D2/4），依据公式每搏输出量（stroke volume，SV）=VTI×CSA得到每一心动周期跨瓣的血流量即SV，乘以HR得到心输出量（cardiac output，CO），超声心动图主机可以自动计算。图6是经LVOT测量心排血量的分析方法。
图6 TEE经LVOT测量CO（2.79 L/min）Fig.6 TEE measures CO via LVOT(2.79 L/min)
1.2.5 记录数据
在全身麻醉气管插管后30 min，血流动力学稳定时，记录实时HR和MAP，获取2～3个心动周期的TEE和TTE图像，存图分析。
记录以下参数：①血流动力学指标HR、MAP、SV、CO、LVEF、RVEF；
②使用荷兰飞利浦Qlab软件进行自动心肌运动量化（automated cardiac motion quantitation，aCMQ），定量分析心肌应变力和同步化运动指标LS-ME4、LS-ME2、LS-ME3、GLS、GL Time SD、MCS、GC Time SD、LS-RV、RV Time SD。
1.3 统计学方法
采用Stata 10.1统计软件进行统计学分析。计量资料先检验其是否符合正态分布，正态分布的资料以均数±标准差表示，标准误（s）及95%CI表示，偏态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）[M（Q）]表示，相关性分析采用Pearson相关分析。
2.1 经食管超声心动图监测方法
10头健康猪顺利完成TEE监测，其三个主要长轴切面获得方法见表1。探头在食管中段深度为（44.7±4.8）cm时，增加扇面角度并轻微旋转探头可获得ME-4C、ME-2C，但继续增加角度至70°～100°并不能直接获得ME-3C，需适当调整探头深度至（45.5±3.9）cm。见表1。
表1 TEE获得食管中段3个主要切面时探头深度及扇面角度Tab.1 Probe depth and sector angle by TEE at 3 main sections of mid-esophageal segment
2.2 健康猪的血流动力学指标、左右心室应变与同步化指标结果
2.2.1 健康猪血流动力学指标
HR为（69.6±15.3）次/分，MAP为（85.5±6.2）mmHg；
由频谱多普勒技术测得的SV为（59.46±11.00）mL，CO为 （4.083±0.968）L/min，LVEF为（56.82±7.76）%，RVEF为（48.45±10.34）%。见表2。
表2 健康猪基本血流动力学指标Tab.2 Basic hemodynamic indexes of healthy swine
2.2.2 左心室应变与同步化指标
左心室GLS为（26.6±3.7）%，GL Time SD为（73.8±31.8）ms，MCS为（23.2±4.4）%，GC Time SD为（53.5±23.3）ms。见表3。
表3 左心室应变与同步化指标Tab.3 Left ventricular strain and synchronization indexes
2.2.3 右心室应变与同步化指标
表4 右心室同步化指标RV Time SDTab.4 Right ventricular synchronization index RV Time SD
2.3 左心室整体纵向应变与每搏量、左心室射血分数相关性分析
GLS与SV没有明显相关性，而LVEF与GLS呈正相关[r=0.742，决定系数（R2）=0.55，P＜0.05）。见表5。
表5 GLS与SV、LVEF相关性分析Tab.5 Correlation analysis of GLS with SV and LVEF
笔者通过在全身麻醉下对健康猪模型进行TEE监测，依据围术期TEE指南调整探头深度和角度总结出食管中段各切面的获得方法。当探头深度为（44.7±4.8）cm、角度在0°～15°时可获得四腔心切面，增加角度至35°～60°可获得两腔心切面，调整探头深度为（45.5±3.9）cm、角度70%～100°可获得三腔心切面。
笔者研究得出各参数的生理范围如下：健康猪的血流动力学指标95%CI HR（58.6～80.6）次/分、MAP（81.4～90.2）mmHg、SV（51.59～67.33）mL、CO（3.390～4.776）L/min、LVEF（51.27～62.37）%、RVEF（41.05～55.85）%；
左心室应变与同步化指标的95 % CI为LS-ME4（23.1～33.3）%、LS-ME2（23.1～31.1）%、LSME3（22.1～27.1）%、GLS（24.0～29.3）%、GL Time SD（51.1～96.5）ms、MCS（20.0～26.4）%、GC Time SD（36.8～70.2）ms；
右心室应变的95%CILS-RV（22.2～28.6）%。右心室同步化指标RV Time SD为中位数44.0（34.8，64.0）ms，中位数95%CI（29.2～82.7）ms。同时分析得出LVEF与GLS呈正相关（r=0.742，R2=0.55）。
2D-STI是基于二维高帧频灰阶图像的超声心动图新技术，通过评估二维应变可提供整体和局部左心室功能的定量信息。与多普勒技术不同，其不受声束方向与室壁运动方向夹角的影响，无角度依赖性，且具有较高分辨率，能更准确地评价心肌应变和同步化运动[5，6]。
心肌应变是指在心动周期中心肌的变形能力，不易受周围心肌牵拉和整体运动的干扰，能客观评价收缩舒张功能，可用于评估局部缺血后的心肌功能障碍[7]。有研究证明，局部心肌力学的应变参数能够预测多巴酚丁胺应激期间局部心肌灌注变化，定量应变参数可以用于缺血检测，并提高超声心动图的准确度可重复性[8]。Rong LQ等[9]研究证明右心室功能与游离壁变形相关，包括LS的改变。另有研究者使用复苏离体猪心对超声应变成像进行验证，证明在量化心肌整体和局部变形模式2D-STI确实是一种可控、可重复的实用技术，并且验证了使用LS和环向应变能准确反应心脏泵功能，经超声技术分析的应变模式和幅度与流量传感器测量的CO之间有良好的一致性[1]。
正常心脏的收缩是由电-机械耦联引起各节段心肌的同步收缩，这是保证心室舒张期充盈和收缩期有效射血的前提。心肌收缩期达峰时间标准差（Time SD）是通过2D-STI来评价心室同步性及收缩功能的重要指标，Time SD能反映心室内电-机械延迟时间离散度，若离散度越大表示室内运动不同步性越明显[10，11]。
体质量50 kg左右的家猪心脏和血管的解剖结构与人体十分相似，越来越多地应用于多种心血管病理生理模型，包括肺动脉反流[12]、失血性休克模型[13]、经导管治疗模型[14]、心肺复苏模型[15]等。先前有国外学者使用慢性心肌梗死猪模型来研究局部心肌应变，包括梗死区域和远端心肌的运动，通过评估纵向和环向应变率及生化指标证明梗死节段LS、环向应变明显低于非梗死节段，并存在明显的左心室重塑，但是由于猪心脏结构和胸部解剖的差异使用经胸超声具有一定局限性，造成的结果就是并非所有的动物模型都能采集到目标切面的高质量图像，并且仅依靠3组对照数据，在各参数生理范围不明确和样本量较小的前提下，评估实验组的数据存在一定误差[2]。无论在人类医学还是兽医学领域，与常规TTE相比，TEE可以获得始终如一高分辨率且易分析的心脏基础解剖结构图像。近期有动物研究证明，在左心室和心房面积、体积的测量及SV、射血分数的评估，TEE与TTE和心脏MRI相比，3种技术获得的测量值差异均无统计学意义；
在2D-STI、三维斑点追踪技术分析心肌应变参数中，TEE组与TTE组差异也无统计学意义[16]。因此，笔者通过建立TEE监测的动物模型，探讨动物猪的麻醉方法、心脏切面的获取等来进一步定量分析健康猪心脏的心肌应变和心室内同步化运动等参数，并计算各参数正常值参考范围和可信区间，为2D-STI在动物实验中的应用提供合理参数和对比资料，为进一步临床教学和科学研究提供初步参考。值得注意的是，笔者研究中关于应变分析的结果与成年人心室功能正常值也较为接近[17]，进一步证明了动物猪模型研究能够为临床研究提供参考。
笔者研究仍存在一些局限性，由于猪解剖结构的特殊性，TEE监测并不能完整地获得所有与实验相关的切面图像，例如经胃短轴乳头肌水平切面无法显像，从而改用TTE配合实验。因此，应增加所有实验切面对应的TTE图像，并与TEE的测量值的比较，会增加研究结果的可靠性和准确性。另外，在实验数据处理的过程中发现，RV Time SD不符合正态分布，且左心室GL Time SD和GC Time SD的离散程度较大，这可能由于样本量相对不足，或者采样时间点偏少造成。除此之外，此次动物模型均是麻醉状态下获得的实时监测数据，尚需进一步实验以获得长期监测的生理参数。
综上所述，笔者研究使用健康猪模型，明确了行TEE监测时的麻醉方法和切面获得的CI，证明了基于2D-STI使用Qlab软件可以定量分析健康猪模型心肌应变和心室内同步化运动，确定各参数正常值参考范围，为进一步开展心脏疾病模型和血流动力学监测研究提供了对比资料。
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