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李 莉, 熊海平, 严炳清, 田微微, 蔡秀丽
禽流感病毒属正粘病毒科，有多个血清型，能感染人和多种动物。甲型流感病毒粒子囊膜上的血凝素 (hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(neuraminidase, NA)决定了病毒的血清分型。已报道人类感染的的禽流感病毒亚型有H4、H5、H9、H7、H6 和 H10等亚型。值得注意的是，低致病性H5和H7亚型禽流感病毒感染家禽后，经常会由于HA基因发生突变而成为高致病性禽流感病毒[1]，亚型重组病毒的出现使禽流感的防治更加困难。通过分析2019-2021年南通市活禽市场外环境禽流感病毒的流行特征，了解本地活禽市场禽流感病毒分布特点，掌握禽类相关外环境中禽流感病毒的检出状况和变化趋势，为高效防控提供科学依据。
1.1 材 料
1.1.1 样本来源 本次研究采用了2019-2021年南通市崇川区、通州区、海安市、如皋市的活禽市场外环境禽流感病毒检测数据，采样选取笼具表面擦拭物，清洗禽鸟类的污水和禽鸟类饮水等外环境标本，采好的标本用3 mL的病毒保存液装载，并置4 ℃条件下保存，于 24 h 内送实验室进行核酸检测。
1.1.2 试剂核酸 提取试剂盒，上海之江生物科技股份有限公司；
流感病毒(甲、乙型)双重核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，国械注准20193400100，深圳生科原生物股份有限公司；
人感染H7N9禽流感病毒RNA检测试剂盒(荧光PCR探针法)、禽流感病毒H9亚型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，粤食药监械生产许20040999号，中山大学达安基因股份有限公司；
禽流感病毒H5N1亚型核酸检测试剂盒(荧光RT-PCR法)，江苏达伯药业有限公司。
1.1.3 仪器核酸 提取仪器：上海之江生物EX3600全自动核酸提取仪。核酸扩增仪器：Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System。
1.2 方 法
1.2.1 检测方法 标本采集后在4 ℃条件下48 h内送至实验室，采用实时荧光反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对标本进行甲型流感(FluA)核酸检测，阳性样本再进行H7、H9、H5亚型检测；
50 ℃ 15 min，95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，58 ℃(H7) / 55 ℃(H9) 45 s，45个循环。42 ℃ 20 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，51 ℃ 40 s，40个循环(H5)。具体检测依据参照《江苏省环境及职业从业人群动物流感监测方案》。
1.2.2 统计学分析 采用 Excel 2013软件录入并整理全部检测数据，应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，各组阳性率之间的比较采用χ2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
2.1 总体监测情况 2019-2021年随机采集南通市崇川区、通州区、海安市、如皋市的活禽市场外环境样本650份。甲型禽流感病毒核酸阳性率为21.69%(141/650)。其中H5亚型阳性率为0.62%(4/650)、H7亚型阳性率为0.31%(2/141)、H9亚型阳性率为18.62%(121/650)、混合亚型(样品中无H亚型，只有N2、N6、N8、N9亚型)阳性率为2.15%(14/650)(表1)。
2.2 地区分布 崇川区检出甲型禽流感病毒核酸阳性样本52份，阳性率为 32.50%(52/160)；
通州区检出阳性样本30份，阳性率为18.18%(30/165)；
海安市检出阳性样本0份，阳性率为0(0/165)；
如皋市检出阳性样本59份，阳性率为36.88%(59/160)；
各监测地区禽流感病毒核酸阳性率差异有统计学意义(χ2=79.619，P<0.001)。除海安市，崇川区、通州区、如皋市的H9亚型阳性率均高于H5和H7亚型。通州区的混合亚型阳性率(5.45%)高于其他监测点，各监测点的不同亚型阳性率差异有统计学意义(χ2=27.623，P<0.001)，见表1。
表1 2019-2021年南通市活禽市场外环境标本禽流感病毒阳性率地区分布情况Tab.1 Regional distribution of avian influenza virus positivity rates outside live poultry markets in Nantong City, 2019-2021
2.3 时间分布 2019-2021年南通市活禽市场禽流感病毒核酸检出率逐年升高。H5和H7型集中在每年第一季度出现，H9分布在全年4个季度中，并在第四季度中阳性率达到最高。2019-2021年的4个季度中检出禽流感病毒核酸阳性率分别为15.00%(52/160)、20.50%(41/200)、25.63%(41/160)、26.92%(35/130)，各季度阳性率差异有统计学意义(χ2=7.937，P<0.05)，见图1、表2。
图1 2019-2021年南通市活禽市场禽流感病毒核酸检出率Fig.1 Nucleic acid detection rate of avian influenza virus in live poultry markets of Nantong City, 2019-2021
表2 2019-2021年南通市活禽市场外环境禽流感病毒阳性率各季度分布情况Tab.2 Seasonal distribution of avian influenza virus positivity rate outside live poultry markets in Nantong City, 2019-2021
2.4 标本类型分布 共采集禽鸟笼具表面、宰杀或摆放禽肉案板表面、禽鸟粪便或肛拭子、清洗禽鸟类的污水、禽鸟类饮水、禽鸟内脏共6大类样本。禽鸟内脏样本阳性率最高，达到 50.00%；
其次是宰杀或摆放禽肉案板表面擦拭子，阳性率为 40.57%；
禽鸟粪便或肛拭子的阳性率最低14.36%；
各类标本的阳性率差异有统计学意义(χ2=40.041，P<0.001)，见表3。
表3 2019-2021年南通市活禽市场外环境禽流感病毒阳性率样本类型分布情况Tab.3 Distribution of avian influenza virus positive samples in the environment inlive poultry markets in Nantong City, 2019-2021
自2018年11月江苏省首次报告人感染H5N6亚型禽流感病例以来，H9N2 和 H5N6 病毒是目前江苏省活禽市场主要流行的禽流感病毒[1]。此次研究显示，南通市活禽市场的主要流行的禽流感病毒亚型和与全省情况相符，其中H9亚型的阳性率在地区分布和时间分布上都是最高。H5和H7亚型禽流感病毒的阳性率与全省的低流行水平一致[2]，且只在崇川区的活禽市场中零星出现。
地区分布显示，南通市的如皋市活禽市场中禽流感病毒阳性率高于其他3个监测地区，各监测地区活禽市场外环境禽流感病毒检出率差异较大，阳性率在0～36.88%，监测地区阳性率按地理方位由北向南依次降低。海安市的阳性检出率为0，可能与当地活禽市场清洁消毒频率及活禽市场准入规定有关，需做进一步调查研究。
从季度分布看，2019-2021年南通市活禽市场禽流感病毒核酸检出率逐年升高。活禽市场的H5和H7型集中在每年第一季度出现，H9分布在全年四个季度中，并在第四季度中阳性率达到最高。提示冬春季节为活禽市场禽流感重点防控时节[3-4]。
不同标本类型结果显示，禽流感病毒外环境污染程度存在明显差异，其中禽鸟内脏样本阳性率和宰杀或摆放禽肉案板表面擦拭子阳性率最高，即污染程度最严重，这与梅州市、衢州市、珠海市的调查结果[5-7]一致。提示在进行市场环境清洁消毒时，应将宰杀或摆放禽肉案板表面和清理禽类内脏作为重点消毒对象。海安市与如皋市均有三种样本采集数无，可能与各地区不同的生活习惯和方式有关，该些地区应规范管理活禽市场，增加采样种类。
综上所述，各类型动物流感对人类的潜在威胁持续存在[8-9]。为及时分析环境及动物中流感病毒的变异情况及分布特点，掌握禽流感病毒致病力和传播力的变化，应继续加强禽流感病毒病原学的监测力度，根据监测结果制定综合性的防控措施；
切实做好活禽市场禽流感防控工作，降低人群感染的风险。
利益冲突：无
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