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毕长富，曾思恒，何 娟，龚利娟，王风青，杨雷军
（四川轻化工大学生物工程学院，四川 宜宾 644000）
γ-氨基丁酸（GABA）是一种非蛋白质氨基酸，是脑内主要的神经递质抑制剂[1]。GABA 通过增加氧传递和血流量来改善脑细胞代谢，促进人体精神安定、血液循环，增加大脑氧气供给等功能，并参与调节生长激素分泌、蛋白质生成、脂肪燃烧和降低血压[2]。GABA 能抑制谷氨酸的脱氨反应，使谷氨酸转化为尿素排出体外，使血氨降低，解除氨毒，增进肝功能[3]。它还具有抗氧化、抗抑郁、抗失眠和止痛作用，被用于非免疫性疾病、中风、神经紊乱和糖尿病控制以及癫痫、哮喘等病理的治疗[4-5]。
随着人们的生活质量越来越高，对传统食品也提出了更深层次的要求，研发各种功能性食品已成为现下的一个研究热点，GABA 作为一种功能性因子，被应用于各类食品当中。利用产GABA 生产菌株，发酵富含GABA 的发酵产品就是其研究方向之一。李婷等[6]通过植物乳杆菌发酵制备出了含有GABA 的乳酸菌饮料。Kantachote 等[7]将高产GABA的菌株用于发酵香肠的制作，以产GABA 的戊糖片球菌HN8 和那慕尔乳杆菌NH2 为混合发酵剂发酵猪肉香肠，得到的产品中GABA 含量达396.2 mg/100 g。EL-Fattah 等[8]利用浓缩乳清蛋白强化的脱脂乳粉发酵酸奶，在发酵剂中添加能赋予酸奶高粘特性和产GABA 混合菌后发现，酸奶中GABA 含量达1.64 mg/100 mL，是相应的只添加具有高粘性菌株处理组的4.56 倍。石洋华[9]利用高产GABA 的酵母菌KS45-180，酿造富含GABA 的保健梨酒，梨酒的酒精度为9.4 度、GABA 的含量达到101.42 mg/L，超过安琪酵母产量，口感类似于普通梨酒。对于发酵食品的制备，发酵剂是关键，直投式发酵剂属于高效浓缩型发酵剂的一种，不需要经过菌种活化、增殖培养和逐级扩大培养过程，是一种可直接应用于生产的体积微小、活菌量高、活力强的新型发酵剂[10]。
本文通过单因素及响应面相关试验对产GABA酵母菌HU-TS3进行增殖培养基成分及其培养条件优化，为制备直投式菌粉，研发各种富含GABA功性发酵食品提供参考。
1.1 材料与仪器
所选酵母菌HU-TS3 由四川轻化工大学生物工程学院生物发酵技术及应用试验室分离筛选及保藏；
葡萄糖（AR）购于成都市科伦化工试剂厂；
可溶性淀粉（AR）、蔗糖、乳糖、溴甲酚绿（AR）均购于西陇科学股份有限公司；
乙醛酸（AR）、琥珀酸（AR）购于成都市科隆化学品有限公司；
普通蛋白胨、琼脂粉（生化试剂）购于北京奥博星生物技术有限责任公司；
酵母浸粉（生化试剂）购于山东西亚化学工业有限公司；
PDA 培养基（生化试剂）购于北京三药科技开发公司。
UV752N 紫外可见分光光度计，上海诺科仪器仪表有限公司；
YXQ-LS-18SI 立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；
FA2004N精密电子天平，杭州万特衡器有限公司；
BCM-1000A 生物洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；
H10-50133 生化培养箱，天津宏诺仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 培养基及培养条件
种子培养基：葡萄糖浓度为20 g/L、普通蛋白胨浓度为20 g/L、酵母浸粉浓度为10 g/L、pH 为自然条件，装液量为50 mL/250 mL 三角瓶，在30 ℃、180 r/min恒温摇床中震荡培养24 h。
筛选培养基：葡萄糖浓度为20 g/L、普通蛋白胨浓度为20 g/L、酵母浸粉浓度为10 g/L、溴甲酚绿浓度为0.1 g/L、琥珀酸浓度为2 g/L、乙醛酸浓度为2 g/L、琼脂浓度为20 g/L，在37 ℃条件下恒温培养48 h。
高密度培养基础培养基：葡萄糖浓度为20 g/L、普通蛋白胨浓度为20 g/L、酵母浸粉浓度为10 g/L、味精浓度为10 g/L，pH 为自然条件，装液量为50 mL/250 mL 三角瓶，在37 ℃、150 r/min 恒温摇床中震荡培养。
1.2.2 酵母菌HU-TS3菌株活化
将酵母菌HU-TS3 斜面菌株，采用平板划线法接种到种子培养基和筛选培养基平板上，在30 ℃恒温培养箱中培养2 d，观察菌落形态。挑取培养基上单菌落接种到液体种子培养基中，在30 ℃、180 r/min恒温摇床中震荡培养24 h，得到种子液。
1.2.3 酵母菌HU-TS3生长曲线测定
按3%的接种量，将种子液接种于10 mL/50 mL三角瓶中，在30 ℃、180 r/min 恒温摇床中培养，从0 h 开始，每隔2 h 取样，在560 nm 处测定吸光度（OD）[11]，测得的吸光度要保证在0.2～0.8[12]之间。以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制酵母菌HU-TS3生长曲线。
1.2.4 酵母菌HU-TS3 增殖培养基及条件优化单因素试验
选取可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、果糖、糊精5种碳源进行单因素试验，检测560 nm处的OD值以确定最佳碳源种类，接着设置碳源浓度为25、30、35、40 g/L与45 g/L进行单因素试验[13]，以确定最佳浓度。
设置普通蛋白胨浓度依次为10、15、20、25 g/L与30 g/L[14]，酵母浸粉浓度依次为5、10、15、20 g/L 与25 g/L，分别进行单因素试验，检测560 nm 处的OD值以确定最佳氮源种类及浓度。
设置接种量依次为1%、2%、3%、4%(v/v)与5%(v/v)[15]，培养基初始pH 为4、5、6、7、8、未调[15]，培 养时间设置为12、24、36、48 h 与60 h[16]，装液量 为5 mL/250 mL、10 mL/250 mL、15 mL/250 mL、20 mL/250 mL 与25 mL/250 mL，分别进行单因素试验，检测560 nm 处的OD值以确定最佳接种量、初始pH、培养时间及装液量。
1.2.5 响应面相关试验设计
依据单因素试验的结果利用Plackett-Burman设计筛选对酵母菌HU-TS3 增殖影响显著因子，采用n= 12 的Plackett-Burman 设计（因素水平值见表1），选取6个因素，其中，高水平“1”是低水平“-1”的1.5～2.0 倍。对于试验结果，分别计算各因素的效应，并进行t检验，选择置信度大于95%的因素作为显著因素进一步考察。
表1 Plackett-Burman设计因素水平
依据Plackett-Burman 设计试验结果，选取P＜ 0.1 的因素，如果因素呈现正效应，就从低水平往上增加；
呈现出负效应，则从高水平往下减少；
其他影响不显著的取最优水平进行试验，每个显著因子的步长根据单因素试验的结果确定。
确定最显著因素的最优水平，逼近最大产区后，进行响应面中心组合试验设计（因素水平设计见表2），以试验结果拟合建立描述响应量（OD560nm）与自变量（影响菌体增殖的显著因素）关系的多项式回归模型，再对拟合方程进行规范性分析，寻找回归模型的稳定点，得到最大OD560nm时显著因素的最优水平，并进行试验验证。
1.3 数据处理
所有单因素试验，都进行3组平行试验并重复3次，数据的处理及作图用Office 2016-Excel 工作表完成；
响应面试验设计及数据分析，采用Minitab19与Design Expert10软件完成。
2.1 酵母菌HU-TS3菌株活化及特性观察
将斜面酵母菌HU-TS3 用生理盐水制成菌悬液，将其进行稀释涂布和平板划线，于30 ℃条件下恒温培养48 h，观察菌落形态。由图1(a)可以观察到单菌落呈乳白色，圆形，突起，边缘齐整，表面光滑。由图1(b)可以看出，菌落呈蓝绿色，是因为当菌体合成GABA时，会与培养基中添加的乙醛酸、琥珀酸及溴甲酚绿发生专一性显色反应，使其表现为蓝绿色[17]。
图1 菌落形态
2.2 酵母菌HU-TS3生长曲线
酵母菌HU-TS3 生长曲线如图2 所示。由图2可知，酵母菌HU-TS3 的对数生长期为4～12 h，在此时间段生长速率达到最大，菌体活力最好，所以选择种子液培养时间为10 h。
图2 酵母菌HU-TS3生长曲线
2.3 酵母菌HU-TS3增殖培养基优化
2.3.1 碳源种类及浓度对酵母菌HU-TS3 增殖的影响
碳源种类及浓度对微生物生长十分重要，碳不仅可作为细胞的基本骨架，还可作为化能异养型微生物的能源物质。由图3(a)可知，与其他碳源相比，当葡萄糖作为碳源时，OD值最大，原因可能是葡萄糖作为单糖分子进入细胞内参与代谢合成比多糖更为容易，所以选择葡萄糖作为酵母菌HU-TS3 增殖培养基的碳源[18]。当葡萄糖浓度为40 g/L 时，OD560nm最大（见图3(b)）。
图3 不同碳源和葡萄糖浓度对酵母菌HU-TS3增殖的影响
2.3.2 氮源浓度对酵母菌HU-TS3增殖的影响
氮源对微生物生长有着十分重要的影响，作为培养基中的主要成分，能够很大程度上影响菌体的生长情况。由图4 可知，当蛋白胨浓度为20 g/L、酵母浸粉浓为15 g/L 时，OD560nm达到最大，与董硕等[19]研究结果一致。
2.4 培养条件对酵母菌HU-TS3增殖的影响
2.4.1 接种量对酵母菌HU-TS3增殖影响
接种量的多少，影响着菌种生长调整期，也与菌种生长速率相关。接种量太少，生长速度相对降低，无法在培养基中快速成为优势菌，杂菌快速生长而染菌；
接种量过大，会造成短时间内培养基营养成分大量减少，导致菌体快速自溶。由图5可知，当接种量为3%时，培养液OD560nm最大。
图5 接种量对酵母菌HU-TS3增殖影响
2.4.2 初始pH对酵母菌HU-TS3增殖的影响
pH的高低会影响微生物体内酶的活性，同时还会影响培养基成分的理化性质与培养基成分吸收情况，从而影响菌株的生长代谢。由图6可知，当初始pH 为6.00 时，培养液OD560nm达到最大，为20.05，与自然条件（pH = 5.87）下OD560nm值（19.83）相近。单艺等[20]在假丝酵母菌Y-2生长特性研究中发现酵母菌的最佳培养pH 值为5.50。综上选定自然条件下的pH作为酵母菌HU-TS3增殖的最佳初始pH。
图6 初始pH对酵母菌HU-TS增殖的影响
2.4.3 培养时间对酵母菌HU-TS3增殖的影响
培养时间的长短对菌体浓度有着显著的影响，由图7 可知，当培养时间达到36 h，培养液OD560nm达到最大，因此酵母菌HU-TS3 的高密度培养时间选择36 h。
图7 培养时间对酵母菌HU-TS3增殖影响
2.4.4 装液量对酵母菌HU-TS3增殖影响
装液量是影响培养基溶氧的因素之一，对于三角瓶摇床培养，装液量越少，溶氧越大。由图8 可知，装液量越大，培养液OD560nm越小。当装液量为5 mL/50 mL 三角瓶时，酵母菌HU-TS3 培养液OD560nm最大，此时锥形瓶的装液系数为0.10。刘梅等[15]研究发现，当装液系数为0.11时，酵母菌的增殖效果显著。因此，酵母菌HU-TS3 在三角瓶摇床高密度培养时的装液系数选择0.10。
图8 培养时间对酵母菌HU-TS3增殖影响
2.5 响应面相关试验
2.5.1 Plackett-Burman试验设计
Plackett-Burman 试验结果见表3，各因素的系数估计和效应评价见表4。由表4 可知，对酵母菌HU-TS3 培养液中OD560nm值有显著影响(置信度大于95%，P＜ 0.05)的因素有3 个：葡萄糖、蛋白胨及酵母浸粉，且均呈现正效应。
表3 Plackett-Burman 试验设计及响应值(n=12)
表4 Plackett-Burman 设计中各因素系数的估计及效应评价(α=0.05，置信度为95%)
2.5.2 最陡爬坡试验确定中心点
由表5 可知，OD560nm最大区在第3 次试验附近，以试验3作为响应曲面试验因素水平的中心点，即：葡萄糖浓度为50 g/L，蛋白胨浓度为30 g/L，酵母浸粉浓度为25 g/L。
表5 最陡爬坡试验设计及结果
2.5.3 响应面设计确定最显著因素的最优水平
利用Minitab 19 软件对葡萄糖、蛋白胨和酵母浸粉设计3 因素3 水平的响应面中心组合试验，试验结果见表6，响应值的方差分析见表7。
表6 Box-Behnken试验设计及结果
表7 响应值的方差分析
由表7 可知，所选择的回归模型的P值为0.0011，表明该整体模型具有可信度；
失拟项的P值为0.1257，失拟项检验不显著，模型选择适当。一次项A、二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜ 0.01）、交互项A×B对结果影响较显著（P＜ 0.1）。调整后的R2= 94.16%，表明94.16%的酵母菌HU-TS3培养液的OD560nm变化可由此模型解释。OD560nm（Y）对葡萄糖浓度（A）、蛋白胨浓度（B）和酵母浸粉浓度（C）的多元二次回归方程为：
葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉3个因素两两交互作用对酵母菌HU-TS3 菌液OD560nm的影响如图9 所示。由图9 可知该方程有最大值，利用软件分析计算，葡萄糖浓度为51.27 g/L、蛋白胨浓度为29.63 g/L、酵母浸粉浓度为25.08 g/L时，菌液OD560nm最大为34.4631。考虑实际操作可行性，将上述最优条件修正为葡萄糖浓度为51 g/L、蛋白胨浓度为30 g/L，酵母浸粉浓度为25 g/L。以此最优条件进行3次重复试验，测得酵母菌HU-TS3菌液平均OD560nm为34.606，与预测拟合度达99.59%，表明优化模型可靠。
图9 两两交互作用对酵母菌HU-TS3菌液OD560nm的影响
通过对产GABA 的酵母菌HU-TS3 进行高密度培养条件优化，在最佳的培养条件下活菌数达到8.1 × 109CFU/mL，为优化前的两倍多。随着人们生活水平的不断提高，对食品的要求也越来越高，各种功能性发酵食品的研制，成为目前食品研发的热点之一。利用产γ-氨基丁酸酵母菌发酵研制各种富含功能性因子γ-氨基丁酸的发酵食品也是趋势之一。发酵成功与否关键因素在于菌株，直投式菌剂是目前各种发酵企业首选的接种方式，酵母菌HU-TS3高密度培养条件优化研究为大规模产γ-氨基丁酸酵母菌直投式菌体的制备提供了理论依据。
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