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王皓梵，李颖颖，王媛媛，田庆丰，封全灵
1)郑州大学第三附属医院妇产科 郑州 450052 2)郑州大学公共卫生学院社会医学与卫生事业管理学教研室 郑州 450001
宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤[1]，目前化疗被认为是晚期或复发性宫颈癌的标准治疗方法，但较大的毒副作用限制了其临床应用[2-3]。血管生成在肿瘤生长和转移中起着至关重要的作用[4]。呋喹替尼(fruquintinib,FRU)是我国自主研发的小分子血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)抑制剂[5]，能够高选择性、强效抑制VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3[6]。但FRU具有疏水性，在血液循环过程中对肿瘤细胞选择性较差、循环性低，而且现阶段剂型单一，这些在一定程度上限制了FRU在临床上的应用[4,7]。聚合物类胶束目前已被认为是最具潜力的纳米药物递送体系之一[8]。该胶束以纳米材料为载体，将药物选择性输送至病变部位，在特定外部条件[9]或靶标刺激下实现药物释放[10-13]。研究[14-15]发现，肿瘤微环境的酸度(pH 5.8～6.5)远高于血液(pH 7.4)，因此pH响应型载药胶束作为一种新型抗肿瘤药物载体，有着很大的开发潜能。此外，纳米药物递送系统的开发应在确保疗效的同时减少对正常细胞的损害[16-18]，其中靶向整合素受体是最常用的方法之一[19]。目前，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(RGD)及其衍生物已被广泛用作整合素的配体。RGD的环状结构(cRGD)比线性结构具有更好的选择性和稳定性[14]。本研究拟设计一种负载FRU的酸敏感靶向胶束(cRGD-FRU-acid sensitive targeted micelle，cRGD-FRU-ASM)，以达到优异的抗肿瘤效果，同时减小毒副作用，报道如下。
1.1 主要试剂及设备FRU购自武汉远成共创科技有限公司，磷脂-聚(2-乙基-2-噁唑啉)(DSPE-PEOz)、磷脂-聚乙二醇2000-环肽(DSPE-PEG2K-cRGD)购自西安瑞禧生物科技有限公司，甲醇、氯仿(色谱纯)购自天津四友精细化学品有限公司，十二烷基硫酸钠购自天津市致远化学试剂有限公司，异硫氰酸荧光素(FITC)购自美国Sigma公司，VEGFR-2抗体购自美国Immuno Way公司。人脐静脉内皮细胞系HUVEC、宫颈癌细胞系Hela购自中国科学院细胞库。
1.2 cRGD-FRU-ASM的制备cRGD-FRU-ASM的制备原理和肿瘤微环境响应示意图见图1。
图1 cRGD-FRU-ASM的制备
以cRGD为靶头，DSPE-PEOz、DSPE-PEG2K-cRGD为药物载体，FRU为模型药物，通过薄膜分散法制备cRGD-FRU-ASM。精密称取一定比例上述材料[m(DSPE-PEOz)∶m(DSPE-PEG2K-cRGD)∶m(FRU)=9∶1∶1]于25 mL茄形瓶中，缓慢滴加3 mL氯仿，超声至完全溶解，于旋转蒸发仪45 ℃低压旋转形成均匀薄膜后，增加旋转蒸发仪压力，彻底除去氯仿。加入PBS(pH 7.4)，继续置于旋转蒸发仪水化，使薄膜完全脱落。取下茄形瓶，将所制备载体置于5 mL EP管中，冰浴下探超(探超功率150 W，探超3 s，停5 s)后，4 ℃避光保存备用。同上步骤分别制备空白载体(cRGD-ASM)、无响应型胶束(cRGD-FRU-M)、无靶头胶束(FRU-ASM)。使用FITC代替没有荧光的FRU，同上制备FITC-ASM和cRGD-FITC-ASM胶束。
1.3 cRGD-FRU-ASM表征测定制备成功的胶束冰浴下探超分散后吸取100 μL于EP管中，加入2 mL超纯水稀释，使用激光粒度分析仪测定粒径、分散指数以及电位，平行测定3次。
另取制备成功的胶束，冰浴下探超分散后吸取适量滴于准备好的铜网，重复进行2～3次，用体积分数0.2%磷钨酸染色，室温下放置，晾干后采用透射电镜观察形态，拍照。将制备好的样品甲醇破乳后，使用高效液相色谱(HPLC)仪测定药物含量。包封率= 胶束载药质量/药物总质量×100%，载药量= 胶束载药质量/(胶束载药质量+ 空白载体质量)×100%。实验重复3次。
1.4 cRGD-FRU-ASM临界浓度的测定根据浓度梯度法将胶束制成系列浓度(0.09、0.18、0.37、0.73、1.46、2.93、5.86、11.72、23.44、46.88、93.75、187.50、375.00、750.00、1 500.00 mg/L)的标准溶液(溶剂为PBS)。在容量瓶中分别加入配制好的以丙酮为溶剂、终浓度为4×10-4g/L的芘-丙酮溶液100 μL，挥干溶剂，继续加入1.5 mL胶束标准溶液，涡旋，避光条件下振摇过夜。使用荧光分光光度仪测定350～450 nm范围内待测溶液的荧光光谱，平行实验5次。荧光条件设置为激发波长334 nm，狭缝宽度2.5 nm，记录373、383 nm处的荧光强度值(I)，计算I373 nm/I383 nm的比值。以胶束浓度(C)的负对数(lgC)为横坐标，I373 nm/I383 nm的比值为纵坐标绘图，曲线突变处横坐标即为胶束临界浓度的负对数。
1.5 cRGD-FRU-ASM药物体外释放效率精密移取cRGD-FRU-ASM 1 mL于透析袋(载留相对分子质量为3 500)中，将其置于含0.5 g/L十二烷基硫酸钠的PBS透析介质中，分别调节透析介质pH为7.4、6.5、5.0。分别于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72 h取样，采用HPLC法测定各时间点FRU释放量。以无响应型胶束cRGD-FRU-M为对照。实验重复3次。
1.6 cRGD-FRU-ASM体外抗肿瘤活性测定
1.6.1cRGD-FRU-ASM对Hela细胞的增殖抑制作用 首先观察空白载体对正常细胞活力的影响。选取对数生长期的HUVEC接种于96孔板。培养24 h后，在避光条件下用含有不同浓度(6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00 mg/L)空白载体cRGD-ASM的培养基刺激24或48 h，加入20 μL MTT，继续培养4 h，弃培养液，加入180 μL的二甲基亚砜，37 ℃摇床摇晃20 min。用酶标仪检测490 nm处的吸光度(A)，计算细胞存活率。存活率=(A实验组-A空白对照组)/(A对照组-A空白对照组)，空白对照组仅有PBS溶液，对照组仅有细胞和培养基。实验重复3次。
另取对数生长期的Hela细胞接种于96孔板，培养24 h后，在避光条件下，用含不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 mg/L)FRU或cRGD-FRU-ASM的培养基处理，同上方法检测作用24 h或48 h后的细胞存活情况。实验重复3次。
1.6.2细胞摄取实验 将处于对数生长期的Hela细胞以每孔2×105个均匀铺于6孔板内，培养24 h，弃去旧培养基，分别加入含游离FITC、FITC-ASM、cRGD-FITC-ASM的培养基(FITC浓度均为2.5 mg/L)，继续培养1、2、4 h，弃去培养基。用PBS清洗3遍，收集细胞，加入200 μL PBS吹打成单细胞悬液保存在冰盒中，用流式细胞仪检测Hela细胞对不同制剂的摄取情况。
1.6.3Transwell实验 迁移实验分为6组：空白对照组(PBS)、空白载体组(cRGD-ASM)、FRU组(根据预实验结果，FRU的浓度取3 mg/L)、无响应型胶束组(cRGD-FRU-M)、无靶头胶束组(FRU-ASM)、终制剂组(cRGD-FRU-ASM)。将含有上述制剂的无血清Hela细胞悬液分别加入Transwell上室中，将含有高浓度血清(体积分数20%)的培养基加入下室中。孵育24 h后，用脱脂棉擦掉上室中没有迁移的细胞，然后用40 g/L多聚甲醛溶液固定20 min，再用PBS进行清洗，清洗后用10 g/L结晶紫染色20 min。用PBS清洗掉上室表面的浮色后，显微镜下拍照，计数进入下室的Hela细胞。侵袭实验为在上室中预先加入20 μL稀释后的基质胶，其余步骤与迁移实验相同。迁移率(侵袭率)=实验组下室Hela细胞数/空白对照组下室Hela细胞数×100%。实验均重复3次。
1.6.4HUVEC小管形成实验 基质胶以50 μL/孔加入96孔板中，放置于37 ℃细胞培养箱中过夜固化，之后用PBS水化。加入含有不同制剂(同1.6.3分组)的单细胞悬液，静置常规培养6 h后，显微镜下观察HUVEC小管形成情况：每组随机取5个视野(×20)，计数每个视野里的小管数，取均值。实验重复3次。
1.6.5HUVEC中VEGFR-2蛋白表达的检测 将生长状态良好的HUVEC细胞传代，待其贴壁后，用不同制剂(同1.6.3分组)进行刺激，继续培养24 h后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化，收集沉淀，用RIPA裂解液处理后在4 ℃、12 000×g条件下离心15 min。采用Western blot检测VEGFR-2蛋白的表达，VEGFR-2一抗按1∶1 000稀释，以β-actin为内参。目的蛋白的表达水平以目的蛋白条带和内参条带灰度值的比值表示。实验重复3次。
1.7 统计学处理采用GraphPad Prism 8.0进行统计学分析和统计图绘制。采用单因素方差分析和SNK-q检验比较各组Hela细胞迁移率、侵袭率、HUVEC小管形成数及VEGFR-2蛋白表达水平的差异。检验水准α=0.05。
2.1 cRGD-FRU-ASM的表征cRGD-FRU-ASM为乳白色混悬液，粒径大小均一，分散性良好。cRGD-FRU-ASM的粒径约为31.89 nm，分散指数为0.231，电位为-17.4 mV。透射电镜下可见cRGD-FRU-ASM胶束为规整的近圆形(图2)。胶束对FRU有较好的包封，包封率为(96.4±0.9)%，载药量为(8.8±0.7)%。
图2 透射电镜下的cRGD-FRU-ASM
2.2 cRGD-FRU-ASM的临界浓度图3中的突变点所对应浓度即为临界浓度的负对数，换算得到临界浓度为4.267 mg/L。
图3 cRGD-FRU-ASM浓度曲线
2.3 cRGD-FRU-ASM药物体外释放效率见图4。cRGD-FRU-ASM中FRU的释放量随pH的降低逐渐增多，pH 7.4时，FRU累积释放量不到30%，pH 5.0时，FRU累积释放量约80%。而各pH条件下cRGD-FRU-M FRU的释放量无明显差异。
图4 cRGD-FRU-ASM的体外药物释放效率
2.4 cRGD-FRU-ASM对Hela细胞的增殖抑制作用不同浓度空白载体cRGD-ASM刺激HUVEC 24 h和48 h后，细胞存活率均超过80%(图5A)，提示空白载体对细胞活力的影响很小。
与相同浓度的FRU相比，终制剂cRGD-FRU-ASM处理后Hela细胞存活率降低，且处理48 h的细胞活力均低于24 h(图5B)。
2.5 Hela细胞对不同制剂摄取量的比较Hela细胞对不同制剂的摄取量不同，对游离FITC的摄取量在1、2、4 h时分别为4.6%、7.5%和15.3%，对无靶头制剂FITC-ASM的摄取量为13.3%、36.5%和47.4%，而对有靶头终制剂cRGD-FITC-ASM的摄取量分别为43.0%、82.5%和96.7%。
2.6 不同制剂对Hela细胞迁移和侵袭的抑制作用Transwell迁移实验结果(图6A、B)与Transwell侵袭实验结果(图6C、D)一致，空白对照组(PBS)和空白载体组(cRGD-ASM)迁移细胞数最多，含有FRU的各实验组制剂均能不同程度地抑制Hela细胞迁移，其中终制剂组(cRGD-FRU-ASM)迁移和侵袭细胞数均少于其他各实验组，迁移率和侵袭率最低(F=194.840、84.119，P均<0.001)。
2.7 各组HUVEC小管形成数量及VEGFR-2蛋白表达量的比较空白对照组和空白载体组可以清晰看到完整的环状小管结构，含有FRU的制剂组(FRU组、无响应型胶束组、无靶头胶束组、终制剂组)小管形成数量明显减少，其中终制剂组(cRGD-FRU-ASM)内皮细胞小管形成数量最少(F=98.260，P<0.001)，无明显完整的小管形成(图7)。
Western blot实验结果显示，含有FRU的各制剂组HUVEC细胞中VEGFR-2的水平均有所降低，且终制剂组最低(F=158.664，P<0.001)(图8)。
A：cRGD-ASM对HUVEC增殖的影响；
B：FRU和cRGD-FRU-ASM对Hela增殖的影响
A、B:迁移实验结果；
C、D:侵袭实验结果；
a:空白对照组；
b:空白载体组；
c:FRU组；
d：无响应型胶束组；
e:无靶头胶束组；
f:终制剂组；
*：P<0.05
a:空白对照组；
b:空白载体组；
c:FRU组；
d：无响应型胶束组；
e:无靶头胶束组；
f:终制剂组；
*：P<0.05
a:空白对照组；
b:空白载体组；
c:FRU组；
d：无响应型胶束组；
e:无靶头胶束组；
f:终制剂组；
*：P<0.05
FRU可以抑制酪氨酸激酶的活性，起到抗血管生成的作用，作用靶点是VEGFR激酶家族[5]。本研究采用薄膜分散法成功制备了酸敏感靶向胶束cRGD-FRU-ASM，对其进行了形态观察，并分别测定了包封率、载药量及临界浓度；
再分别以pH 7.4、6.5、5.0模拟正常组织、肿瘤组织以及肿瘤微环境，考察cRGD-FRU-ASM的体外药物释放情况；
为观察Hela细胞对cRGD-FRU-ASM的摄取情况，本实验选择具有强烈黄绿色荧光的FITC代替没有荧光的FRU，观察FITC、FITC-ASM、cRGD-FITC-ASM在Hela细胞内的摄取情况；
接着进行cRGD-FRU-ASM体外抗肿瘤活性的观察。既往研究[8]显示在新生血管形成后期，HUVEC已经完成迁移和侵袭，内皮细胞会逐渐形成小管状的结构。本实验通过小管形成实验体外观察cRGD-FRU-ASM对内皮小管形成的抑制情况，评价其体外抗血管生成作用[20]。
本实验制备的cRGD-FRU-ASM粒径在30 nm左右，呈规整的近圆形，大小均匀，分散性良好。该载体制剂临界浓度低，表明cRGD-FRU-ASM可用于静脉注射，具有较高的稳定性和较长的微循环时间，从而具有更有效的肿瘤杀伤作用。MTT实验结果显示，空白载体cRGD-ASM对HUVEC几乎没有杀伤作用，证明本研究选用的靶向胶束载体具有良好的生物安全性。cRGD-FRU-ASM在肿瘤微酸环境中FRU释放量最高，同时Hela细胞对靶向胶束的摄取率大大提高，可实现药物在肿瘤组织的富集和摄取；
终制剂(cRGD-FRU-ASM)刺激的细胞活力低于FRU，这可能是由于FRU的半衰期较短，而用胶束包裹后形成的终制剂延长了FRU的释药时间，增强了对Hela细胞生长及侵袭、迁移的抑制作用。此外，各组细胞内皮小管形成数量及VEGFR-2蛋白表达量进一步证实cRGD-FRU-ASM具有较好的抗血管生成作用。
综上所述，cRGD-FRU-ASM靶向胶束可实现FRU在肿瘤组织的富集，提高了FRU的利用度，可能是一个有潜力的FRU新剂型。然而本研究仅考察了体外抗肿瘤活性，其长期安全性和有效性有待进一步验证。
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